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Mecanismo de la ADN ligasa

Mecanismo de la ADN ligasa



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No puedo entender qué sucede con los fosfatos del ATP. ¿Para qué se utilizan? ¿Para cargar el extremo 3 'o el extremo 5'?


Cuando ligas dos hebras de ADN, construyes un enlace fosfodiéster. Para hacerlo, necesita energía, y esta energía para la ADN ligasa proviene del ATP (en las bacterias, esta energía también puede provenir de NAD+. La enzima metaboliza ATP a AMP + PPI y une el AMP en su centro activo. Luego, el AMP está involucrado en la reacción en sí y luego se libera. Esta página tiene algunas ilustraciones sobre este proceso. Si desea profundizar mucho en el tema, eche un vistazo a esta revisión:


Ligasas de ADN: mecanismo y funciones

LIG4 (ADN ligasa IV)

La ADN ligasa IV tiene una región C-terminal extendida que contiene motivos BRCT dispuestos en tándem ( Figura 2 ). La región enlazadora entre los dos motivos BRCT media una interacción con la proteína de reparación del ADN XRCC4 que se requiere para la estabilidad y la actividad de la ADN ligasa IV. La estabilidad de la ADN ligasa IV también está influenciada por la fosforilación de Ser650 por la proteína quinasa dependiente de ADN (ADN-PK). A diferencia de las ADN ligasas I y III, la mayoría de las moléculas de ADN ligasa IV en el complejo ADN ligasa IV / XRCC4, después de la purificación, están pre-adeniladas y solo catalizan un único evento de ligación. Sin embargo, la proteína de reparación de ADN XLF, que interactúa con XRCC4, estimula la unión de extremos de ADN compatibles e incompatibles mediante ADN ligasa IV / XRCC4.


¿Cuál es la función de la ADN ligasa?

La ADN ligasa es una enzima que repara las irregularidades o roturas en la columna vertebral de las moléculas de ADN de doble hebra. Tiene tres funciones generales: sella las reparaciones en el ADN, sella los fragmentos de recombinación y conecta los fragmentos de Okazaki (pequeños fragmentos de ADN formados durante la replicación del ADN bicatenario). La ADN ligasa funciona formando un enlace entre el final de un nucleótido & ldquodonor & rdquo y el final de un nucleótido & ldquoacceptor & rdquo.

Hay dos tipos principales de ADN ligasa y mdash, el primero se encuentra solo en células procariotas (células sin núcleo, como las bacterias). El segundo se encuentra en células eucariotas (células con núcleo, como las de plantas y animales), así como en virus y bacteriófagos. Además, los mamíferos tienen cuatro subtipos de ligasas que varían en su función. La ADN ligasa III, por ejemplo, contiene una proteína de reparación de ADN, llamada XRCC1, que sella la ruptura en la hebra de ADN que ocurre durante la reparación por escisión de nucleótidos. En general, las ADN ligasas eucariotas son mucho más grandes que sus homólogas procariotas; la ADN ligasa más pequeña es producida por el bacteriófago T7.

Debido a que la ADN ligasa juega un papel tan importante en ayudar con la reparación y replicación del ADN, es un componente importante de los experimentos de recombinación genética, incluida la clonación.


Rasgos estructurales característicos

Estructuras de dominio

De acuerdo con su descendencia de un ancestro común, todas las ADN ligasas eucariotas dependientes de ATP están relacionadas en secuencia y estructura. La Figura 1 muestra una representación esquemática de las estructuras de dominio de las ADN ligasas I, III y IV de células eucariotas junto con otros miembros de la familia. Con la excepción de la enzima viral PBCV-1 atípicamente pequeña, dos dominios proteicos son comunes a todos los miembros de la familia. El dominio catalítico (CD) comprende seis motivos de secuencia conservada (I, III, IIIa, IV, V-VI) que definen una familia de nucleotidiltransferasas relacionadas que incluyen enzimas que rematan el ARNm eucariotas dependientes de GTP, así como ligasas eubacterianas dependientes de NAD + [ 4]. El motivo I incluye el residuo de lisina que se adenila en el primer paso de la reacción de ligación. Muchas de las enzimas que se muestran en la Figura 1 también contienen un dominio no catalítico (NCD) que se conserva, aunque débilmente, entre diferentes miembros de la familia. Se desconoce la función de este dominio.

Estructuras de dominio de ligasas dependientes de ATP. Representación esquemática de las estructuras de dominio de las ligasas I, IIIα, IIIβ y IV de ADN, junto con ligasas dependientes de ATP de poxvirus (vaccinia, variola, viruela aviar, etc.), el virus Chlorella de Paramecium bursaria PBCV-1 y arqueas. Abreviaturas: CD, dominio catalítico NCD, dominio no catalítico conservado PBM, motivo de unión a PCNA NLS, señal de localización nuclear MTS, secuencia de direccionamiento mitocondrial ZnF, putativo dedo de zinc BRCT, dominio relacionado con el terminal carboxi de BRCA. Las regiones de caja roja tienen sus estructuras resueltas cristalográficamente, las regiones de caja azul se encuentran solo en proteínas dirigidas a las mitocondrias.

Además de los dominios CD y NCD, las proteínas de la ADN ligasa I nuclear de diferentes especies también tienen un dominio amino terminal de longitud variable y conservación de secuencia baja que incluye una secuencia de localización nuclear (NLS) y, en el extremo amino terminal, un extremo amino conservado. Motivo de unión a PCNA (PBM) del tipo identificado por primera vez en el inhibidor de la replicación del ADN de mamíferos p21 Cip1 [5]. El PCNA (antígeno nuclear de células en proliferación) se conoce mejor como factor de procesividad de la ADN polimerasa, pero cada vez hay más pruebas de que desempeña un papel importante en la coordinación de las interacciones proteína-proteína en el ADN. El PBM se encuentra en el extremo amino de las enzimas de la ligasa I de ADN nuclear de levaduras y vertebrados, así como en varios otros factores de reparación y replicación del ADN, como la subunidad grande del factor de replicación C del 'cargador de pinza' (RF- C), que carga PCNA en el ADN, y la nucleasa FEN1 [5].

En la levadura en ciernes, el uso de diferentes codones de inicio da como resultado la traducción de distintas iso-formas nucleares y mitocondriales de la proteína ADN ligasa I Cdc9 [6]. La traducción del primer AUG da lugar a una preproteína con una secuencia de dirección mitocondrial amino-terminal (MTS). Esta preproteína se localiza en las mitocondrias, después de lo cual la MTS es escindida por una peptidasa mitocondrial. La forma nuclear de la proteína, que carece de MTS, se traduce de un AUG interno en marco [6].

El gen de la ADN ligasa III utiliza un mecanismo similar para producir proteínas nucleares y mitocondriales [7, 8]. Además, el empalme alternativo de pre-mRNA da como resultado la producción de isoformas (ADN ligasas IIIα y IIIβ con diferentes secuencias carboxi-terminales [9]. La ADN ligasa IIIα es la más larga de las dos isoformas: en su carboxilo terminal tiene un dominio BRCT (Dominio relacionado con el terminal carboxi de BRCA), un módulo de proteína de plegamiento autónomo de aproximadamente 95 aminoácidos que se identificó por primera vez en la región carboxi-terminal de la proteína supresora de tumores BRCA1, pero que desde entonces se ha encontrado en una variedad de proteínas implicadas en el ADN replicación, reparación del ADN y funciones de punto de control [10]. Este dominio está ausente en la ADN ligasa IIIβ, cuya expresión se limita a los tejidos de la línea germinal [7,8,9]. Ambas isoformas de la ADN ligasa III incluyen un motivo de dedo de zinc putativo (ZnF ) ubicado en el extremo amino terminal de los dominios NCD y CD. El motivo ZnF tiene una gran similitud de secuencia con los dedos de zinc presentes en la poli (ADP-ribosa) polimerasa del factor de respuesta al daño del ADN y puede facilitar la unión al elemento de estructura secundaria del ADN s, como los que se pueden encontrar en los sitios de daño del ADN o como intermediarios en el metabolismo del ADN [11, 12].

Las enzimas ADN ligasa IV se caracterizan por una prolongada extensión carboxi-terminal que comprende dos dominios BRCT [13, 14]. Los dominios BRCT están separados por una secuencia de enlace corta, de alrededor de 100 aminoácidos, que contiene un sitio de unión conservado para la proteína de unión de ADN ligasa IV Xrcc4 [15, 16].

Estructuras tridimensionales

Aunque se conoce la estructura tridimensional de una única ADN ligasa eucariota, la codificada por el virus PBCV-1 [17], también se ha resuelto la estructura del bacteriófago T7 ligasa [18], lo que permite comparar las dos. Quizás como era de esperar, las estructuras comparten un alto grado de similitud a pesar de su bajo nivel de similitud de secuencia primaria (Figura 2a, 2b). Cada proteína comprende dos subdominios distintos: un gran subdominio amino-terminal ("dominio 1") y un subdominio carboxi-terminal más pequeño ("dominio 2"). El sitio de unión de ATP de la enzima se encuentra en la hendidura entre los dos subdominios. La estructura del núcleo catalítico es similar a la de las ligasas eubacterianas dependientes de NAD + y las enzimas eucarióticas de protección de ARNm dependientes de GTP, lo que refleja su historia evolutiva compartida. Como se puede ver en la Figura 2b, el dominio 1 consta de dos hojas β antiparalelas flanqueadas por hélices, mientras que el dominio 2 consta de un barril β de cinco hebras y una hélice única y ejemplifica el pliegue OB (unión de oligonucleótidos) que se encuentra en una amplia una variedad de proteínas de unión a ácidos nucleicos tales como el factor de unión a ADN monocatenario eucariótico RPA.

Estructuras de ADN ligasas dependientes de ATP. (a, b) Estructuras tridimensionales de (a) el bacteriófago T7 ADN ligasa complejado con ATP y (b) el virus Chlorella de Paramecium bursaria (PBCV-1) Complejo enzima-adenilato de ADN ligasa, determinado por cristalografía de rayos X. Para la enzima PBCV-1, se indican los dominios 1 y 2 (un pliegue OB). (CD) Estructuras de los dominios BRCT de (c) el factor de reparación del ADN humano Xrcc1 y (d) ADN ligasaIIIα, determinadas por cristalografía de rayos X y RMN (resonancia magnética nuclear), respectivamente. En cada caso, cuatro hebras β cortas forman el núcleo de la estructura BRCT. El núcleo de Xrcc1 está flanqueado por tres hélices α (α1, α2 y α3) mientras que el de la ADN ligasa IIIα está flanqueado por solo dos (α1 y α2). La interacción entre las proteínas Xrcc1 y la ADN ligasa IIIα en vivo está mediada por estos dominios BRCT. (mi) Estructura de un homodímero de Xrcc4 unido a un péptido corto correspondiente a los aminoácidos 748-784 de la ADN ligasa IV humana (mostrada en verde). (F) Vista de cerca del péptido ADN ligasa IV unido a las colas helicoidales del dímero Xrcc4. El péptido comprende una horquilla β seguida de una hélice α y se encuentra asimétricamente a través de ambos monómeros Xrcc4. Consulte el texto para obtener detalles y referencias.

Dos conjuntos de estudios han arrojado luz sobre la estructura y función de las regiones no catalíticas de las ligasas eucariotas. En el primero de ellos, la estructura de la solución del dominio BRCT carboxi-terminal de la ADN ligasa IIIα se resolvió mediante RMN [19]. Esta región de la proteína participa en la unión al factor de reparación del ADN Xrcc1. La estructura (que se muestra en la Figura 2c) comprende una hoja de cuatro hebras β paralelas con un paquete de dos hélices α y muestra una similitud significativa con otros dominios BRCT, como el del propio Xrcc1 [20], aunque este último tiene una característica adicional hélice ubicada en el lado opuesto de la hoja β (α2 en la Figura 2d).

Más recientemente, se ha determinado la estructura de la región de interacción con Xrcc4 de la ADN ligasa IV, en un complejo con un homodímero Xrcc4 [16]. La propia proteína Xrcc4 tiene un dominio de cabeza amino-terminal globular seguido de una cola helicoidal larga (Figura 2e). En la estructura cristalina, un único polipéptido derivado de la ADN ligasa IV (correspondiente a 36 aminoácidos ubicados entre los dominios BRCT carboxi-terminales) interactúa simultáneamente con las colas helicoidales de ambos monómeros pero de manera asimétrica. El péptido se pliega en un motivo en forma de placa, que comprende una horquilla β adyacente a una hélice α corta (Figura 2f), que se encuentra a través de las superficies de las colas de monómero Xrcc4 adyacentes.


La ADN ligasa III y la ADN ligasa IV llevan a cabo formas genéticamente distintas de unión de extremos en células somáticas humanas.

El C-NHEJ (unión de extremos clásica no homóloga) dependiente de Ku es la vía primaria de reparación de EJing (unión de extremos) del ADN en mamíferos. Recientemente, se ha descrito una vía de reparación adicional de EJing (alternativa A-NHEJ-NHEJ). Actualmente, el mecanismo de A-NHEJ es oscuro, aunque a menudo está implicada una dependencia de LIGIII (ADN ligasa III). Para probar el requisito de LIGIII en A-NHEJ, construimos una línea celular humana condicionalmente nula LIGIII utilizando el direccionamiento de genes. La actividad de EJing nuclear no pareció verse afectada por una deficiencia en LIGIII como, sorprendentemente, también lo fueron los eventos de integración de dirección genética aleatoria. Por el contrario, LIGIII era necesario para la función mitocondrial y esto definía la actividad esencial del gen. Sin embargo, las líneas celulares de doble desactivación Ku: LIGIII y Ku: LIGIV (ADN ligasa IV) humanas demostraron que se requiere LIGIII para la actividad mejorada de A-NHEJ que se observa en las células deficientes en Ku. Sin embargo, lo más inesperado es que la mayoría de los eventos de EJing siguieron siendo dependientes de LIGIV. En conclusión, aunque el LIGIII humano tiene una función esencial en el mantenimiento mitocondrial, es prescindible para la mayoría de los tipos de reparación de DSB nuclear, excepto para los eventos A-NHEJ que normalmente son suprimidos por Ku. Además, describimos que existe una vía de reparación robusta, independiente de Ku y dependiente de LIGIV, en las células somáticas humanas.

Palabras clave: A-NHEJ C-NHEJ Reparación de rotura de doble cadena Dirigido al gen Recombinación homóloga Ku Ligase III Ligase IV Unión de extremos no homólogos.

Copyright © 2014 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

Cifras

Generación de una LIGIII condicionalmente nula ...

Generación de una línea celular LIGIII condicionalmente nula. (A) Confirmación por PCR de LIGIII flox / -…

Una deficiencia de LIGIII provoca crecimiento ...

Una deficiencia de LIGIII causa retraso en el crecimiento, pero no hipersensibilidad a los agentes que dañan el ADN.…

Una deficiencia de LIGIII no ...

Una deficiencia de LIGIII no afecta la actividad total de unión final. (A) Una caricatura de…

Las células LIGIII-nulas tienen mediación por microhomología normal ...

Las células nulas para LIGIII tienen una actividad de unión de extremos mediada por microhomología normal. (A) Después EcoRV y AfeI restricción…

Una deficiencia de LIGIII no ...

Una deficiencia de LIGIII no afecta la frecuencia relativa de la orientación genética mediada por rAAV ...

Se requiere LIGIII para microhomología mediada ...

Se requiere LIGIII para eventos A-NHEJ mediados por microhomología normalmente reprimidos por Ku. (A) El ...

Se requiere LIGIII, y no LIGIV, para eventos EJing mediados por microhomología normalmente reprimidos por ...

Un nuevo modelo para las vías de EJing en células somáticas humanas (A) El viejo ...

EJing independiente de Ku es dependiente de LIGIV. (A)…

EJing independiente de Ku es dependiente de LIGIV. (A) Perfiles de ensayos de EJing utilizando el reportero pEGFP-Pem1-Ad2…


Diferentes tipos de ADN ligasa:

ADN ligasa I: liga el ADN naciente en la hebra rezagada, especialmente, los espacios entre los fragmentos de Okazaki.

ADN ligasa II: La ADN ligasa II no se considera una verdadera ligasa porque no tiene su propio gen, la ADN ligasa II eucariota sintetizada a partir del gen que codifica la ADN ligasa III.

Participa principalmente en la vía de reparación del ADN.

ADN ligasa III: se requiere en la reparación del ADN, especialmente, en la reparación por escisión de nucleótidos. Es el único tipo de ligasa que también está presente en el ADN mitocondrial.

ADN ligasa IV: La ADN ligasa IV es muy especial porque une el ADN bicatenario. Está involucrado en la vía de reparación de rotura de doble hebra, particularmente, en la unión de extremos no homólogos.

Además, también es necesario para la unión del fragmento V (D) J.


ADN: tipos de daños y mecanismos de reparación (con diagrama)

Hagamos un estudio en profundidad de los tipos de daño del ADN y los mecanismos de reparación. Los tipos de daño del ADN son: 1. Mutaciones simples 2. Desaminación 3. Bases faltantes 4. Modificación química de bases 5. Formación de dímeros de pirimidina (dímeros de timina) y 6. Roturas de hebra. Los diversos mecanismos de reparación del ADN son: 1. Reparación directa 2. Reparación de escisión 3. Reparación de base no coincidente 4. Sistema de recuperación o reparación de recombinación y 5. Mecanismo de reparación SOS.

Introducción al daño y la reparación del ADN:

El ADN es una molécula muy estable y versátil. Aunque a veces se le causa el daño, es capaz de mantener la integridad de la información contenida en él. La perpetuación del material genético de generación en generación depende de mantener las tasas de mutación en un nivel bajo. El ADN tiene muchos mecanismos elaborados para reparar cualquier daño o distorsión.

Las fuentes más frecuentes de daño al ADN son la inexactitud en la replicación del ADN y los cambios químicos en el ADN. El mal funcionamiento del proceso de replicación puede conducir a la incorporación de bases incorrectas, que no coinciden con la hebra complementaria. Los químicos que causan el daño rompen la columna vertebral de la hebra y alteran químicamente las bases. La alquilación, oxidación y metilación dañan las bases. Los rayos X y las radiaciones gamma provocan roturas en el ADN de una o dos hebras.

Un cambio en la secuencia de bases si se replica y pasa a la siguiente generación se vuelve permanente y conduce a una mutación. Al mismo tiempo, también son necesarias mutaciones que proporcionan materia prima para la evolución. Sin la evolución, la nueva especie, ni siquiera los seres humanos, hubieran surgido. Por tanto, es necesario un equilibrio entre mutación y reparación.

Tipos de daño:

El daño al ADN incluye cualquier desviación de la estructura habitual de doble hélice.

1. Mutaciones simples:

Las mutaciones más simples son el cambio de una base por otra. En la transición, una pirimidina se sustituye por otra piramidina y una purina por otra purina. La versión trans implica la sustitución de una piramidina por una purina y una purina por una pirimidina como T por G o A y A por C o T. Otras mutaciones simples son la detección, la inserción de un solo nucleótido o una pequeña cantidad de nucleótidos. Las mutaciones que cambian un solo nucleótido se denominan mutaciones puntuales.

2. Desaminación:

La alteración común de la forma o daño incluye la desaminación de la citosina (C) para formar uracilo (u), cuyas bases se emparejan con la adenina (A) en la siguiente replicación en lugar de la guanina (G) con la que se habría emparejado la citosina original.

Como el uracilo no está presente en el ADN, la base de adenina se empareja con la timina (T). Por lo tanto, el par C-G se reemplaza por T-A en el siguiente ciclo de replicación. De manera similar, la hipoxantina resulta de la desaminación de la adenina.

3. Bases faltantes:

La escisión del enlace N-glicosídico entre la purina y el azúcar provoca la pérdida de la base de purina del ADN. A esto se le llama depurinación. Este sitio apurínico se convierte en una lesión no codificante.

4. Modificación química de bases:

La modificación química de cualquiera de las cuatro bases del ADN conduce a bases modificadas. Los grupos metilo se agregan a varias bases. La guanina forma 7- metilguanina, 3-metilguanina. La adenina forma 3-metiladenina. La citosina forma 5- Metilcitosina.

El reemplazo del grupo amino por un grupo ceto convierte la 5-metilcitosina en timina.

5. Formación de dímeros de pirimidina (dímeros de timina):

La formación de dímeros de timina es muy común en la que se forma un enlace covalente (anillo de ciclobutilo) entre bases de timina adyacentes. Esto conduce a la pérdida del emparejamiento de bases con el soporte opuesto. Una bacteria puede tener miles de dímeros inmediatamente después de la exposición a radiaciones ultravioleta.

6. Roturas de hebra:

A veces, los enlaces fosfodiéster se rompen en una hebra de la hélice de ADN. Esto es causado por varios químicos como peróxidos, radiaciones y por enzimas como DNasas. Esto conduce a roturas en la columna vertebral del ADN. Las roturas de hebra única son más comunes que las roturas de hebra doble.

A veces, los rayos X, los rayos electrónicos y otras radiaciones pueden provocar la rotura de los enlaces fosfodiéster en ambas hebras, que pueden no ser directamente opuestas entre sí. Esto conduce a roturas de doble hebra.

Algunos sitios del ADN son más susceptibles a sufrir daños. Estos se denominan paradas en caliente.

Mecanismos de reparación:

La mayoría de los tipos de daño crean impedimentos para la replicación o transcripción. Las bases alteradas provocan un emparejamiento incorrecto y pueden provocar una alteración permanente de la secuencia del ADN después de la replicación.

Para mantener la integridad de la información contenida en él, el ADN tiene varios mecanismos de reparación.

1. Reparación directa:

El daño se revierte mediante una enzima reparadora que se denomina fotorreactivación. Este mecanismo involucra una enzima dependiente de la luz llamada ADN fotoliasa. La enzima está presente en casi todas las células, desde bacterias hasta animales. Utiliza energía de la luz absorbida para romper el enlace C-C del anillo ciclobutilo de los dímeros de timina. De esta forma se monomerizan los dímeros de timina.

2. Reparación de escisión:

Incluye reparación por escisión de bases y reparación por escisión de nucleótidos. El sistema de reparación de la escisión de la base involucra una enzima llamada N-glicosilasa que reconoce la base anormal y el enlace glicosídico hidrolésico entre esta y el azúcar.

Otra enzima, una endonucleasa, escinde el esqueleto del ADN en el lado 5 & # 8242 de la base anormal. Luego, la ADN polimerasa por su actividad exonucleasa elimina la base anormal. La ADN polimerasa luego la reemplaza con una base normal y la ADN ligasa sella la región.

El sistema de reparación de nucleótidos incluye tres pasos, incisión, escisión y síntesis. La incisión se realiza mediante la enzima endonucleasa precisamente a cada lado del parche dañado de la hebra. De esta manera se corta la parte dañada de la hebra.

Las enzimas endonucleasas involucradas son UvrA, UvrB que reconocen el tramo dañado de la hebra. UvrC hace dos cortes (incisión) a cada lado. La exonucleasa elimina la hebra dañada. La enzima involucrada es UvrD.

Más tarde, la ADN polimerasa sintetiza la nueva hebra utilizando una hebra complementaria como plantilla. La ADN ligasa forma enlaces fosfodiéster que sellan los extremos de la hebra recién sintetizada.

3. Reparación de la base no coincidente:

A veces se incorporan bases incorrectas durante el proceso de replicación, se forman pares G-T o C-A. La base incorrecta siempre se incorpora solo en la hebra hija. Por lo tanto, para distinguir las dos cadenas con el fin de reparar, las bases de adenina de la cadena molde se marcan o marcan con grupos metilo. De esta manera, se hemimetila la hélice de ADN de nueva replicación. La escisión de bases incorrectas se produce en la hebra hija o no metilada.

4. Sistema de recuperación o reparación de recombinación:

En el dímero de timina u otro tipo de daño, la replicación del ADN no puede realizarse correctamente. Se deja un espacio opuesto al dímero de timina en la hebra hija recién sintetizada. La brecha se repara mediante un mecanismo de recombinación o mecanismo de recuperación llamado también intercambio de hebras hermanas.

Durante la replicación del ADN se producen dos copias idénticas. La molécula de ADN replicante tiene cuatro cadenas A, B, C y D. Las cadenas A y C tienen la misma secuencia de ADN. Las cadenas B y D también tienen la misma secuencia ya que son idénticas. Un dímero de timina está presente en la hebra A. La horquilla de replicación pasa el atenuador ya que no puede formar enlaces de hidrógeno con las bases de adenina entrantes, creando así un espacio en la hebra B recién sintetizada.

En el sistema de reparación por recombinación, se recupera un segmento corto idéntico de ADN de la hebra D y se inserta en el espacio de la hebra B. Pero esto crea un espacio en la hebra D que se llena fácilmente con la ADN polimerasa utilizando la hebra C normal como plantilla. Este evento depende de la actividad de una proteína especial Rec A. La proteína Rec A desempeña su papel en la recuperación de una porción de la hebra complementaria del otro lado de la horquilla de replicación para llenar el espacio. Rec A es una proteína de intercambio de cadenas.

Después de llenar ambos huecos, la timina se monomeriza. Entonces, en este mecanismo de reparación, una parte de la cadena de ADN se recupera del segmento de ADN homólogo normal. Esto también se conoce como mecanismo de reparación de la brecha de la hebra hija.

5. Mecanismo de reparación SOS:

A veces, la maquinaria de replicación no puede reparar la parte dañada y pasa por alto el sitio dañado. Esto se conoce como síntesis de translesión, también llamado sistema de derivación y es un sistema de reparación de emergencia. Este mecanismo está catalizado por una clase especial de ADN polimerasas llamada familia Y de ADN polimerasas que sintetizan el ADN directamente a través de la porción dañada.


Introducción a Ligase

En bioquímica, la ligasa, también llamada sintetasa, es una enzima que cataliza la unión de dos moléculas grandes a través de la formación de un nuevo enlace químico como CO, CS, CN, o la unión de dos compuestos, generalmente acompañada de la hidrólisis de un pequeño grupo químico unido a una de las moléculas más grandes. Este procedimiento generalmente asimila la energía necesaria de la ruptura de un enlace fosfato rico en energía, implica la conservación de la energía química y ofrece un vínculo entre los procesos sintéticos que requieren energía y las reacciones de ruptura que producen energía. En la mayoría de los casos, la conversión simultánea de ATP en adenosina ADP funciona como fuente de energía. La reacción catalizada por ligasa tiene una formulación general como la siguiente:

Nomenclatura

Los nombres comunes de ligasas a menudo contienen la palabra "ligasa", como ADN ligasa, una enzima de uso frecuente en biolaboratorios moleculares para unir fragmentos de ADN. La sintetasa es otro nombre comúnmente adoptado para las ligasas, ya que se aplican en la síntesis de nuevas moléculas. A veces, las sintetasas se distinguen de las sintasas y, a veces, se las trata como sinónimos de sintasas. Desde el punto de vista de la definición, los nucleósidos trifosfatos como ATP, GTP, CTP, TTP y UTP son empleados por las sintetasas para producir energía, mientras que las sintasas no usan nucleósidos trifosfatos. Una sintasa también se reconoce como una liasa que cataliza la ruptura de varios enlaces químicos a través de medios que excluyen la hidrólisis y la oxidación sin demanda de energía, mientras que una sintetasa es una ligasa que une dos sustancias químicas o compuestos con necesidad de energía. La Comisión Conjunta de Nomenclatura Bioquímica (JCBN) ha dictaminado que la sintasa puede representar cualquier enzima que catalice la síntesis, mientras que la sintetasa debe usarse como sinónimo.

Clasificación

En el sistema de clasificación de números CE, las ligasas se clasifican como EC 6 y pueden clasificarse en seis subclases.

Número CE Descripción
EC 6.1 Formar enlaces carbono-oxígeno
EC 6.2 Formar enlaces carbono-azufre
EC 6.3 Formar enlaces carbono-nitrógeno (argininosuccinato sintetasa)
EC 6.4 Formar enlaces carbono-carbono
EC 6.5 Formar enlaces de éster fosfórico
EC 6.6 Forman enlaces nitrógeno-metal, como en las quelatasas.

Aplicaciones de varias ligasas comunes

La ADN ligasa es un tipo específico de enzima que promueve la unión de cadenas de ADN al catalizar la formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato y la desoxirribosa. La ADN ligasa está activa durante el proceso de replicación, reparación y recombinación del ADN. Se aplica ampliamente en la reparación de roturas de una sola hebra en el ADN dúplex de organismos vivos utilizando la hebra complementaria de la doble hélice como plantilla, mientras que algunas formas pueden reparar específicamente los daños de la doble hebra. En los laboratorios de biología molecular, la ADN ligasa purificada se usa ampliamente en la clonación de genes para unir moléculas de ADN y formar ADN recombinante. Otra aplicación innovadora de la ADN ligasa se puede ver en el campo de la nanoquímica, particularmente en el origami de ADN. La ADN ligasa puede ofrecer asistencia enzimática que es esencial para construir la estructura de la red de ADN a partir de ADN colgando, ensamblando así objetos a nanoescala, como nanomáquinas, nanoelectrónicos, biomoléculas y componentes fotónicos.

Como otro ejemplo típico de ligasa, la T4 ARN ligasa 1 es capaz de catalizar la unión covalente dependiente de ATP de los terminales 5'-fosforilo monocatenarios del ARN a los terminales 3'-hidroxilo monocatenarios del ARN. La ligasa 2 de ARN T4 se distingue por residuos de firma críticos y un dominio C-terminal único que es esencial para sellar los extremos del ARN 3'-OH y 5'-fosforilo y también cataliza la unión de un extremo 3'-hidroxilo del ARN a un ARN 5'-fosforilado. A diferencia de T4 RNA ligasa 1, prefiere sustratos bicatenarios y se requiere un sustrato pre-adenilado en la ligación por una forma truncada de T4 RNA ligasa 2. T4 RNA ligasa es capaz de marcar el RNA 3 '-end con citidina 3', 5 '-bis [α-32P] fosfato, induce la circularización de oligonucleótidos sintéticos y genera cebadores compuestos específicos para el sitio para PCR. También se podrían lograr modificaciones específicas de los ARNt con la ayuda de la ligasa de ARN de T4, que también catalizó la unión de oligodesoxirribonucleótidos a ADNc monocatenarios para 5'-RACE.

La ubiquitina ligasa, también llamada ubiquitina ligasa E3, es una enzima que existe como un único polipéptido o un complejo multimérico. E3 La ubiquitina ligasa podría trabajar junto con la enzima activadora de ubiquitina E1 y la enzima conjugadora de ubiquitina E2 que se ha cargado con ubiquitina, para acelerar la ubiquitinación de varios sustratos de proteínas para la degradación dirigida por el proteasoma. La ubiquitina finalmente se une a una lisina en la proteína sustrato a través de un enlace isopéptido y las ligasas E3 podrían interactuar tanto con la proteína diana como con la enzima E2, impartiendo así especificidad de sustrato a la enzima E2. La ubiquitinación por las ligasas de ubiqutina E3 también juega un papel esencial en la regulación de muchos procesos biológicos, como el tráfico celular, la reparación del ADN y la señalización. Es de gran importancia en biología celular. Las ligasas E3 también ocupan un lugar en el control del ciclo celular y la degradación de ciclinas. El genoma humano codifica más de 600 supuestas ligasas E3, lo que da como resultado una enorme diversidad de sustratos, mientras que las E3 podrían determinar la especificidad de los sustratos de proteínas. Investigaciones recientes han encontrado que muchos E3 han estado implicados en enfermedades humanas y son una clase de objetivos atractivos "drugables" para la intervención farmacéutica.

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El descubrimiento de las ligasas de ADN

Dadas sus funciones vitales en la reparación y replicación del ADN, se propuso que existiera la actividad de la ADN ligasa en las células incluso antes de su descubrimiento. Dos observaciones estimularon la búsqueda de ADN ligasas.

  1. Ocurrencia de recombinación genética por rotura y re-unión de moléculas de ADN.
  2. La formación de círculos cerrados por ADN lineal del bacteriófago I después de la infección.

En 1967, los laboratorios Gellert, Lehman, Richardson y Hurwitz descubrieron de forma independiente las ADN ligasas. Desde su descubrimiento, las ADN ligasas se han convertido en herramientas importantes en biología molecular. Las ADN ligasas se utilizan en la clonación molecular para unir fragmentos de ADN para crear ADN recombinante, como cuando se inserta un fragmento de ADN extraño en un plásmido.

La mayoría de las reacciones de ligación involucran fragmentos de ADN que se han generado a partir de digestiones de restricción, con extremos cohesivos o romos. La ligadura se realiza generalmente como una reacción separada después de la digestión de restricción, aunque algunos protocolos describen un método de clonación por PCR de un tubo en el que se permite que la digestión de restricción y la ligadura ocurran simultáneamente en la misma reacción.


Abstracto

La duplicación del genoma se lleva a cabo mediante pares de horquillas de replicación que se ensamblan en los orígenes de la replicación y luego se mueven en direcciones opuestas. La replicación del ADN termina cuando las horquillas de replicación convergentes se encuentran. Durante este proceso, que se conoce como terminación de la replicación, se completa la síntesis de ADN, se desmonta la maquinaria de replicación y se resuelven las moléculas hijas. En esta revisión, describimos los pasos que probablemente sean comunes para la terminación de la replicación en la mayoría de los organismos, a saber, la convergencia en bifurcación, la finalización de la síntesis, el desensamblaje replisoma y la decantación. Repasamos brevemente el mecanismo de terminación en la bacteria. Escherichia coli y en el virus simio 40 (SV40) y también se centran en los avances recientes en la terminación de la replicación eucariota. En particular, discutimos las ligasas de ubiquitina E3 recientemente descubiertas que controlan el desmontaje del replisoma en levaduras y eucariotas superiores, y cómo se regula su actividad para evitar la inestabilidad del genoma.


Consejos y preguntas frecuentes

Hacer controles: Al hacer ligaduras SIEMPRE debe hacer un vector solo + ligasa control. Esto le permitirá verificar que el vector fue completamente digerido y si se trató con fosfatasa, que el tratamiento con fosfatasa funcionó. Este control debería, en principio, estar libre de colonias, pero la realidad es que tendrá cierta cantidad de antecedentes. Lo que quiere ver es que su ligación de vector + inserto tiene muchas más colonias que su ligación de vector solo.

Additional controls are encouraged, but may only be required for troubleshooting failed ligations. The following table indicates the various controls:

Control Ligase Interpretación
Uncut vector - Checks viability of competent cells and verifies the antibiotic resistance of the plasmid
Cut vector - Background due to uncut vector
Cut vector + Background due to vector re-circularization - most useful for phosphatase treated vector
Insert or water + Any colonies indicate contamination of intact plasmid in ligation or transformation reagents

Optimizing the Vector:Insert Ratio: Although a 3:1 insert to vector ratio is usually sufficient, you can optimize the amount of insert and vector to improve ligation efficiency in situations where the 3:1 ratio is not working or when doing more complicated cloning. While 3:1 will get you in the ballpark for average size genes and vectors, this ratio is really meant to refer to the molarity of DNA ends available for ligation. Simply put, there are only two ends on any given piece of DNA no matter how long it is, and therefore we need to adjust the amount of DNA used in a ligation based on the length of the DNA to get a proper ratio of 3 available insert ends for every available vector end. Ligation calculators are easily found on the web. Just enter the concentration, lengths of your insert and vector, and what ratio you want, and it will tell you exactly how much of each to use.


Ver el vídeo: Replicación del ADN (Agosto 2022).