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¿Qué microscopio / aumento necesitaría para observar la bacteria P. Acnes?

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Actualmente estoy intentando cultivar un cultivo de la bacteria P. Acnes. En este momento, mi única esperanza para identificar colonias de bacterias en el cultivo es usar una luz negra para encontrar colonias que brillen en naranja. No estoy seguro de si esto funcionará o no, ya que es posible que el agar nutritivo no les proporcione algo que les ayude a producir porfirinas. También es muy posible que otra forma de bacteria que contamine el cultivo produzca el mismo efecto.

Me gustaría considerar la posibilidad de comprar un microscopio para este proyecto. Nunca he tenido un microscopio de calidad (solo de juguete en el pasado), por lo que realmente no sé qué tipo de microscopio o qué aumento necesitaré para identificar y observar correctamente la bacteria P. Acnes.

Lo interesante es si pudiera convertir esto en un proyecto farmacológico; Si puedo verificar que tengo las bacterias correctas (de todos modos, con un buen grado de certeza), puedo ver cómo reaccionan las bacterias a diferentes productos químicos y entornos.


Estoy de acuerdo con el canadiense en que las pruebas químicas son generalmente más útiles para la identificación. Sin embargo, la morfología ayuda y algunas técnicas de tinción pueden ser útiles para la identificación (la tinción de Gram es la más obvia). Si está buscando un microscopio, busque un buen alcance con un objetivo de inmersión en aceite de 100x y una lente ocular de 10x (12x también estaría bien). Zeiss, Nikon y Olympus son algunos nombres antiguos que son buenos visores, y hay más.


Propionibacterium acnes induce la degeneración de la placa terminal cartilaginosa al promover la expresión de MIF a través de la vía NF-κB

Propionibacterium acnes (P. acnes) es un factor patogénico novedoso que contribuye a la degeneración de la placa terminal cartilaginosa (CEP). Sin embargo, el mecanismo subyacente de P. acnesla degeneración de CEP inducida por el virus sigue sin estar clara. El objetivo de este estudio es investigar el mecanismo subyacente de P. acnes-degeneración de CEP inducida.

Métodos

Primero examinamos la expresión de MIF en muestras de CEP humanas degeneradas mediante inmunohistoquímica. Desarrollamos un P. acnes-Modelo de rata inducido y expresión de MIF detectada mediante inmunohistoquímica. Además, investigamos el mecanismo de P. acnes-degeneración de CEP inducida en células CEP mediante transferencia de Western y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa con transcripción inversa (RT-qPCR).

Resultados

Encontramos que en comparación con el CEP humano normal, la expresión de MIF se incrementó en el CEP humano degenerado. En un modelo de rata, P. acnes indujo la degeneración de CEP y la expresión de MIF regulada al alza de manera significativa. Más importante aún, revelamos el mecanismo subyacente de P. acnes-degeneración de CEP inducida en las células de CEP de rata. Primeramente, P. acnes indujo la expresión de MIF de una manera dependiente de la concentración. Luego, MIF aumentó la expresión de MMP-13 y promovió la secreción de IL-6 e IL-1β. Finalmente, P. acnes puede promover la expresión de MIF a través de la vía NF-κB en lugar de la vía ERK1 / 2.

Conclusión

P. acnesLa expresión de MIF inducida por la vía NF-κB puede ser el mecanismo subyacente de la degeneración de CEP.


Infecciones estafilocócicas de la piel

Estafilococo especies se encuentran comúnmente en la piel, con S. epidermidis y S. hominis siendo prevalente en la microbiota normal. S. aureus también se encuentra comúnmente en las fosas nasales y en la piel sana, pero las cepas patógenas son a menudo la causa de una amplia gama de infecciones de la piel y otros sistemas corporales.

S. aureus es bastante contagioso. Se transmite fácilmente a través del contacto de piel a piel y debido a que muchas personas son portadoras nasales crónicas (personas asintomáticas que portan S. aureus en sus fosas nasales), las bacterias se pueden transferir fácilmente de la nariz a las manos y luego a los fómites u otros individuos. Porque es tan contagioso S. aureus prevalece en la mayoría de los entornos comunitarios. Esta prevalencia es particularmente problemática en los hospitales, donde pueden estar presentes cepas de la bacteria resistentes a los antibióticos y donde los pacientes inmunodeprimidos pueden ser más susceptibles a la infección. Las cepas resistentes incluyen resistentes a la meticilina. S. aureus (MRSA), que se puede adquirir a través de entornos de atención médica (MRSA adquirido en el hospital o HA-MRSA) o en la comunidad (MRSA adquirido en la comunidad o CA-MRSA). Los pacientes hospitalarios suelen llegar a instalaciones sanitarias ya colonizadas por cepas de cepas resistentes a los antibióticos. S. aureus que se puede transferir a los proveedores de atención médica y otros pacientes. Algunos hospitales han intentado detectar a estas personas con el fin de instituir medidas profilácticas, pero han tenido resultados mixtos (consulte Eye on Ethics: Screening Patient for MRSA).

Cuando se desarrolla una infección estafilocócica, la elección de la medicación es importante. Como se mencionó anteriormente, muchos estafilococos (como MRSA) son resistentes a algunos o muchos antibióticos. Por tanto, se mide la sensibilidad a los antibióticos para identificar el antibiótico más adecuado. Sin embargo, incluso antes de recibir los resultados del análisis de sensibilidad, se sospechaba S. aureus Las infecciones a menudo se tratan inicialmente con medicamentos que se sabe que son efectivos contra MRSA, como trimetoprim-sulfametoxazol (TMP / SMZ), clindamicina, una tetraciclina (doxiciclina o minociclina) o linezolid.

La patogenicidad de las infecciones estafilocócicas a menudo se ve reforzada por las sustancias químicas características secretadas por algunas cepas. Los factores de virulencia estafilocócica incluyen hemolisinas llamadas estafilolisinas, que son citotóxicas para muchos tipos de células, incluidas las células de la piel y los glóbulos blancos. Cepas virulentas de S. aureus también son coagulasa positivos, lo que significa que producen coagulasa, una proteína de coagulación del plasma que participa en la formación de abscesos. También pueden producir leucocidinas, que matan los glóbulos blancos y pueden contribuir a la producción de pus y proteína A, que inhibe la fagocitosis al unirse a la región constante de anticuerpos. Algunas cepas virulentas de S. aureus también producen otras toxinas, como la toxina 1 del síndrome de choque tóxico (ver Factores de virulencia de patógenos bacterianos y virales).

Para confirmar el agente causante de una sospecha de infección cutánea estafilocócica, se cultivan muestras de la herida. Bajo el microscopio, grampositivo Estafilococo Las especies tienen arreglos celulares que forman racimos similares a uvas cuando se cultivan en agar sangre, las colonias tienen una pigmentación única que va desde el blanco opaco hasta el crema. Un testículo catalasa utilizado para distinguir Estafilococo de Estreptococo, que también es un género de cocos grampositivos y una causa común de infecciones cutáneas. Estafilococo especies son catalasa-positivas mientras Estreptococo las especies son catalasa-negativas.

Se realizan otras pruebas en muestras de la herida para distinguir especies de coagulasa positivas Estafilococo (CoPS) ​​como S. aureus de especies comunes coagulasa-negativas (CoNS) como S. epidermidis. Aunque los CoNS son menos propensos que los CoPS a causar enfermedades en humanos, pueden causar infecciones cuando ingresan al cuerpo, como a veces puede ocurrir a través de catéteres, dispositivos médicos permanentes y heridas. Se pueden utilizar pruebas de aglutinación pasiva para distinguir CoPS de CoNS. Si la muestra es coagulasa positiva, generalmente se presume que contiene S. aureus. Serían necesarias pruebas genéticas adicionales para identificar la cepa particular de S. aureus.

Otra forma de distinguir CoPS de CoNS es cultivando la muestra en agar con sal de manitol (MSA). Estafilococo las especies crecen fácilmente en este medio porque son tolerantes a la alta concentración de cloruro de sodio (7.5% NaCl). Sin embargo, CoPS como S. aureus fermentar manitol (que será evidente en una placa de MSA), mientras que CoNS como S. epidermidis no fermenta el manitol, pero se puede distinguir por la fermentación de otros azúcares como lactosa, malonato y rafinosa (Figura ( PageIndex <1> )).

Figura ( PageIndex <1> ): (a) Se utiliza una placa de agar con sal de manitol para distinguir diferentes especies de estafilococos. En esta placa, S. aureus está a la izquierda y S. epidermidis está a la derecha. Debido a que S. aureus es capaz de fermentar manitol, produce ácidos que hacen que el color cambie a amarillo. (b) Esta micrografía electrónica de barrido muestra los grupos característicos en forma de uva de S. aureus. (crédito a: modificación del trabajo de & ldquoScienceProfOnline & rdquo / crédito de YouTube b: modificación del trabajo de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades)

EVALUACIÓN DE PACIENTES PARA MRSA

Según los CDC, el 86% de las infecciones invasivas por MRSA están asociadas de alguna manera con la atención médica, en lugar de ser adquiridas en la comunidad. En hospitales y clínicas, los pacientes asintomáticos que albergan MRSA pueden transmitir la bacteria a personas más susceptibles a enfermedades graves.

En un intento por controlar la propagación de MRSA, los hospitales han intentado realizar pruebas de detección de MRSA en los pacientes. Si los pacientes dan positivo después de una prueba de frotis nasal, pueden someterse a descolonización mediante lavados con clorhexidina o mupirocina intranasal. Algunos estudios han informado reducciones sustanciales de la enfermedad por MRSA después de la implementación de estos protocolos, mientras que otros no lo han hecho. Esto se debe en parte a que no existe un protocolo estándar para estos procedimientos. Se pueden utilizar varias pruebas de identificación de MRSA diferentes, algunas con técnicas de cultivo más lentas y otras con pruebas rápidas. Otros factores, como la eficacia de los protocolos generales de lavado de manos, también pueden contribuir a prevenir la transmisión de MRSA. Todavía hay otras preguntas que deben abordarse: ¿Con qué frecuencia se deben realizar exámenes de detección a los pacientes? ¿Qué personas deben someterse a la prueba? ¿De qué parte del cuerpo se deben recolectar las muestras? ¿Se desarrollará una mayor resistencia a partir de los procedimientos de descolonización?

Incluso si se perfeccionan los procedimientos de identificación y descolonización, seguirán existiendo cuestiones éticas. ¿Deberían los pacientes tener derecho a rechazar las pruebas? ¿Un paciente que da positivo en la prueba de MRSA debe tener derecho a rechazar el procedimiento de descolonización y, de ser así, los hospitales deben tener derecho a rechazar el tratamiento del paciente? ¿Cómo equilibramos el derecho del individuo a recibir atención con los derechos de otros pacientes que podrían estar expuestos a enfermedades como resultado?

Infecciones estafilocócicas superficiales

S. aureus a menudo se asocia con pioderma, infecciones de la piel que son purulentas. La formación de pus se produce porque muchas cepas de S. aureus producen leucocidinas, que matan a los glóbulos blancos. Estas infecciones cutáneas purulentas pueden manifestarse inicialmente como foliculitis, pero pueden provocar forúnculos.s o abscesos más profundos llamados ántraxs.

La foliculitis generalmente se presenta como protuberancias y granos que pueden causar picazón, enrojecimiento y / o llenos de pus. En algunos casos, la foliculitis es autolimitada, pero si continúa durante más de unos pocos días, empeora o reaparece repetidamente, puede requerir tratamiento médico. El sudor, las lesiones cutáneas, los pelos encarnados, la ropa ajustada, la irritación por el afeitado y las afecciones de la piel pueden contribuir a la foliculitis. Evitar la ropa ajustada y la irritación de la piel puede ayudar a prevenir infecciones, pero los antibióticos tópicos (y a veces otros tratamientos) también pueden ayudar. La foliculitis se puede identificar mediante inspección de la piel. El tratamiento generalmente se inicia sin cultivar e identificar primero el agente causal.

Por el contrario, los furúnculos (furúnculos) son infecciones más profundas (Figura ( PageIndex <2> )). Son más comunes en aquellas personas (especialmente adultos jóvenes y adolescentes) que practican deportes de contacto, comparten equipo deportivo, tienen mala nutrición, viven en lugares cerrados o tienen sistemas inmunológicos debilitados. La buena higiene y el cuidado de la piel a menudo pueden ayudar a evitar que los furúnculos se vuelvan más infecciosos y, por lo general, se resuelven por sí solos. Sin embargo, si los furúnculos se diseminan, aumentan en número o tamaño, o dan lugar a síntomas sistémicos como fiebre y escalofríos, entonces se necesita atención médica. En ocasiones, es posible que sea necesario drenarlos (momento en el que se pueden cultivar los patógenos) y tratarlos con antibióticos.

Cuando varios forúnculos se convierten en una lesión más profunda, se llama ántrax (Figura ( PageIndex <2> )). Debido a que los ántrax son más profundos, se asocian más comúnmente con síntomas sistémicos y una sensación general de enfermedad. Los ántrax más grandes, recurrentes o que empeoran requieren tratamiento médico, al igual que aquellos asociados con signos de enfermedad como fiebre. Los carbúnculos generalmente deben drenarse y tratarse con antibióticos. Si bien los ántrax son relativamente fáciles de identificar visualmente, se pueden recomendar cultivos y análisis de laboratorio de la herida para algunas infecciones porque la resistencia a los antibióticos es relativamente común.

La higiene adecuada es importante para prevenir este tipo de infecciones cutáneas o para prevenir la progresión de infecciones existentes.

Figura ( PageIndex <2> ): Los furúnculos (forúnculos) y los ántrax son infecciones de la piel causadas a menudo por la bacteria Staphylococcus. (a) Un furúnculo contiene pus y presenta hinchazón. (b) Un ántrax es una lesión llena de pus que suele ser más profunda que el forúnculo. A menudo se forma a partir de múltiples furúnculos. (crédito a: modificación del trabajo de & ldquoMahdouch & rdquo / Wikimedia Commons crédito b: modificación del trabajo de & ldquoDrvgaikwad & rdquo / Wikimedia Commons)

El síndrome de piel escaldada por estafilococos (SSSS) es otra infección superficial causada por S. aureus que se observa con mayor frecuencia en niños pequeños, especialmente en bebés. Las exotoxinas bacterianas primero producen eritema (enrojecimiento de la piel) y luego descamación severa de la piel, como podría ocurrir después de quemaduras (Figura ( PageIndex <3> )). El SSSS se diagnostica examinando las características de la piel (que pueden desprenderse fácilmente), usando análisis de sangre para verificar si hay recuentos elevados de glóbulos blancos, cultivos y otros métodos. Como tratamiento se utilizan antibióticos intravenosos y fluidoterapia.

Figura ( PageIndex <3> ): un recién nacido con síndrome de piel escaldada por estafilococos (SSSS), que produce grandes regiones de piel muerta y descamada. (crédito: modificación del trabajo de D Jeyakumari, R Gopal, M Eswaran y C MaheshKumar)


Materiales y métodos

Declaración de Ética

Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de Experimentos con Animales de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (número de permiso: A3063-01). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia con pentobarbital sódico y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.

Protocolo animal experimental

Utilizamos ratones hembra del Instituto de Investigación del Cáncer (ICR) de tipo salvaje (Harlan de 6 a 8 semanas, Indianápolis, IN) en este estudio como un medio para evaluar la capacidad del péptido antimicrobiano sintético P5 de nuevo diseño para minimizar un Propionibacterium acnes (PAG. acnes) infección, y modular la respuesta inflamatoria innata del huésped como se describió en detalle anteriormente [21]. Se inyectó birefly, P5 (1,6 μM, 20 μl) o PBS (20 μl) por vía intradérmica en los oídos derechos de los ratones ICR 24 horas después PAG. acnes (1 x 108 UFC por 20 μl en PBS) inoculación en el mismo sitio. PAG. acnes se cuantificó colocando diluciones en serie del homogeneizado en placas de agar e incubando en condiciones anaeróbicas durante 48 horas. El grosor de la oreja se midió usando un microcalibre (Mitutoyo 547-400S MSI Viking Gage, Charleston, SC) antes de la inyección y a las 24, 48, 72 y 96 horas después de la inyección. Para todos en vivo experimentos, se utilizaron n = 10 animales / grupo de tratamiento / punto de tiempo a menos que se especifique lo contrario. Se realizaron comparaciones experimentales mediante un modelo ANOVA de medidas repetidas utilizando el software mixto SAS Proc (SAS Institute, Inc., Cary, NC).

Preparación de péptidos sintéticos

Los AMP sintéticos CA-MA (KWKLFKKIGIGKFLHSAKKF-NH2), P5 (KWKKLLKKPLLKKLLKKL-NH2) y P4 (KWKKKKKKPKFL-NH2) se sintetizaron como se describió anteriormente [17]. La solución madre se preparó a una concentración de 1 mM en agua destilada esterilizada y se filtró a través de un filtro de poros de 0,22 µm. La solución filtrada se almacenó a -20 ° C hasta su uso.

Cultivo bacteriano

PAG. acnes (ATCC 11828 y ATCC 6919) (American Type Culture Collection, Manassas, VA) se cultivó en medio clostridial reforzado (BD: Franklin Lakes, NJ) en condiciones anaeróbicas utilizando Gas-Pak a 37 ° C como se describió en detalle anteriormente [21] . Staphylococcus epidermidis (S. epidermidis) (ATCC 12228) se cultivó en caldo nutritivo (BD) en condiciones aeróbicas a 37 ° C. Para la estimulación de los queratinocitos humanos normales (HK), se recolectaron células bacterianas mediante centrifugación a 3000 x gramo durante 10 min a 4 ° C. A continuación, las bacterias se lavaron tres veces con PBS y se resuspendieron en medio de inanición que carecía de hidrocortisona y extracto de pituitaria bovina (BPE) o en PBS a 1 x 108 unidades formadoras de colonias (UFC) / ml.

In vitro ensayos antibacterianos

Las concentraciones bactericidas mínimas (MBC) de los péptidos contra microorganismos anaeróbicos y aeróbicos se determinaron por duplicado en dos experimentos independientes utilizando métodos de microdilución con placas de cultivo celular de microtitulación de 96 pocillos. Los péptidos se filtraron a través de filtros de 0,22 µm y se diluyeron paso a paso en un medio de caldo apropiado hasta concentraciones en el intervalo de 100 µM a 0,39 µM. Las soluciones diluidas en serie 2 veces de cada péptido (100 µl) se mezclaron con 100 µl de suspensión bacteriana hasta una densidad de 2 x 106 UFC / ml. A continuación, las placas se incubaron durante 16 ha 37 ° C en condiciones anaeróbicas o aeróbicas. Después de la incubación, las mezclas de reacción se diluyeron y se colocaron en placas de agar apropiadas para contar las UFC. El MBC se definió como la concentración de péptido más baja que dio como resultado un crecimiento de microorganismos no visible en la placa de agar.

Cultivo de queratinocitos

Los queratinocitos epidérmicos humanos (HK) del prepucio se compraron en PromoCell (Heidelberg, Alemania) y se cultivaron en medio de crecimiento de queratinocitos (KGM Clonetics, San Diego, CA) como se describió en detalle anteriormente [21]. Brevemente, las células HK se cultivaron en KGM a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contenía 5% de CO2. El medio de cultivo celular se cambió cada 2 a 3 días y las células se recolectaron después de los pases 3 a 4. Se sembraron células HK a una concentración de 104 a 105 células por pocillo en placas de cultivo de 6/12/96 pocillos y portaobjetos de cámara. Se permitió que las células crecieran hasta aproximadamente un 70% de confluencia.En las condiciones experimentales requeridas, las células HK se cultivaron en medio de hambre KGM, que está libre de suplementos y factores de crecimiento (BPE, hEGF, insulina, hidrocortisona, epinefrina, transferrina y gentamicina / anfotericina-B).

Microscopía electrónica de barrido (SEM)

SEM se realizó como se describió anteriormente [18]. Todas las muestras se visualizaron usando un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (FE-SEM, JSM-7100F, Jeol, Japón) con un aumento de 20.000x (15,0 kV).

Tratamiento de PAG. acnes y / o péptidos en HK

Después de que los HK cultivados se preinfectaron con PAG. acnes (1x 108 UFC / ml) durante 24 horas, se añadió un péptido sintético (CA-MA, P5 o P4) a cada pocillo a una concentración de 0,8 µM, 1,6 µM o 3,2 µM. Luego, las células se incubaron durante varios períodos como se indica en los resultados. Las células HK cultivadas en medio de inanición solo sirvieron como control negativo. A continuación, se recogieron las células para la extracción de ARN. Los sobrenadantes recogidos por centrifugación a 14.000 x gramo durante 10 min a 4 ° C se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -70 ° C hasta su uso en el ensayo de IL-8 y TNF-α.

RT-PCR cuantitativa

La expresión del ARNm del gen diana se analizó mediante RT-PCR en tiempo real como se describe en el protocolo del fabricante (sistema de PCR en tiempo real ABI 7500 utilizando la mezcla maestra SYBR Green Applied Biosystems, Foster City, CA) como se describe en detalle anteriormente [21]. Las secuencias del cebador fueron las siguientes: para IL-8, 5'-GCAGTTTTGCCAAGGAGTGCT-3 '(sentido) y 5'-TTTCTGTGTTGGCGCAGTGTG-3' (antisentido) para TNF-α, 5'-ATAGCTCCCAGAAAAGCAAGC-3 '(sentido) y '-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3' (antisentido) para TLR2, 5'-TGTCTTGTGACCGCAATGGT-3 '(sentido) y 5'-GTTGGACAGGTCAAGGCTTT-3' (antisentido) y para rRNA 18S, 5'-CGGGACTA-3CCA '-GCTGGAATTACCGCGGCT-3' (antisentido). La cuantificación de la expresión del gen diana se normalizó utilizando un gen de control interno, 18S rRNA [22]. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Los niveles de IL-8 y TNF-α en los sobrenadantes de cultivo recolectados se determinaron usando kits de inmunoensayo de TNF-α e IL-8 humanos (R & ampD Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La densidad óptica de los pocillos se midió usando un lector ELISA ajustado a 450 nm con una corrección de longitud de onda ajustada a 540 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

Tinción inmunofluorescente para la translocación nuclear NF-κB y la localización celular TLR2

El análisis de inmunofluorescencia de la localización de NF-κB y TLR2 se realizó como se describió anteriormente [23]. Brevemente, los HK fueron tratados con PAG. acnes (1 x 108 UFC / ml) durante 30 min para NF-κB o 24 h para TLR2 en presencia o ausencia de P5 o P4 1,6 μM. Luego, las células se incubaron primero con anticuerpo policlonal de conejo anti-NF-κB p65 humano (Rel A) o anticuerpo anti-TLR2 humano de conejo (Rockland, Gilbertsville, PA), diluido 1: 3000 en tampón de bloqueo (kit ImmPRESS Vector Laboratories, Burlingame , CA). Luego se incubaron durante 1 h con IgG de cabra anti-conejo purificada por afinidad conjugada con FITC (dilución 1: 300 H + L Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, GA) a temperatura ambiente en la oscuridad. Finalmente, las células se visualizaron bajo un microscopio (Olympus EX51 Center Valley, PA), y las imágenes se adquirieron usando una cámara QICAM fast 1394 (Westmont, IL).

Ensayo MTT

Se realizó un ensayo colorimétrico estándar para evaluar la viabilidad celular basado en la actividad de las enzimas reductoras MTT (sal de tetrazolio amarillo: bromuro de 3- (4,5-dimethuiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante ( Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) utilizando células HK (5 x 10 3 por 200 μl de medio de cultivo) en presencia y ausencia de P5 o P4 en concentraciones que oscilan entre 1,6 y 6,4 μM. Los datos se presentan como el porcentaje de células HK viables en comparación con el porcentaje de células viables después del tratamiento con Triton X-100 al 2%, que sirvió como control positivo para la citotoxicidad celular.

Análisis de dicroísmo circular (CD) de la unión de P5 al ácido lipoteicoico (LTA)

Los espectros de CD se registraron a 25 ° C en un espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Tokio, Japón) equipado con una unidad de control de temperatura usando una celda de cuarzo con una longitud de trayectoria de 0,1 cm. Los espectros de CD para el péptido 50 µM disuelto en PBS (pH 7,2) se escanearon en presencia o ausencia de LTA al 0,1% disuelto en PBS. Se realizaron al menos cuatro exploraciones del rango de longitud de onda de 250-190 nm, después de lo cual se restaron los espectros en blanco promedio del promedio de los espectros de la muestra.

Análisis de la movilización de Ca 2+ intracelular en queratinocitos

Se evaluó la movilización de Ca 2+ intracelular para evaluar la respuesta funcional de los HK a PAG. acnes-infección en presencia y ausencia de péptidos sintéticos como se describe en detalle anteriormente [21]. Brevemente, los HK cultivados en cubreobjetos se incubaron durante 45 min a 37 ° C en PBS que contenía 2 μM de fura-2 / AM (Invitrogen, Carlsbad, CA), la forma permeable a la membrana de la sonda fluorescente de Ca 2+ fura-2. Después de tres lavados, las células se pretrataron con o sin P5 o P4 1,6 μM, después de lo cual PAG. acnes se añadió durante la monitorización activa de la movilización de Ca 2+ intracelular. La fluorescencia se midió utilizando un sistema de imágenes de fluorescencia IM básico InCyt (Intracellular Imaging Inc., Cincinnati, OH) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de Ca 2+ libre intracelular se determinó midiendo la relación de las emisiones de 510 nm provocadas por excitación a 340 y 380 nm.

Determinación de PAG. acnes abundancia y PAG. acnes-inflamación inducida en vivo

Se inyectó intradérmicamente P5 (1,6 μM, 20 μl) o PBS (20 μl) en los oídos derechos de ratones ICR (Harlan, Indianapolis, IN) 24 h después PAG. acnes (1 x 108 UFC por 20 μl en PBS) inoculación en el mismo sitio. Las orejas izquierdas de los mismos ratones se inyectaron con 20 µl de PBS. En los ratones ICR de control negativo, las orejas derechas permanecieron sin tratar, mientras que las orejas izquierdas recibieron inyecciones intradérmicas de PBS. Se homogeneizaron diez mg de tejido de biopsias con sacabocados de 8 mm tomadas de las orejas 24 horas después de la inyección del péptido en 250 µl de PBS estéril usando un triturador de tejidos. PAG. acnes se cuantificó colocando diluciones seriadas del homogeneizado en placas de agar e incubándolas durante 48 h en condiciones anaeróbicas. El grosor de la oreja se midió usando un microcalibre (Mitutoyo 547-400S MSI Viking Gage, Charleston, SC) antes de la inyección del péptido y a las 24, 48 y 72 horas después de la inyección.

Análisis estadístico

Los resultados se expresan como medias ± DE. Se realizó un ANOVA con probabilidades tanto para la significación general como para la comparación por pares. PAG& lt0.05 se consideró estadísticamente significativo.


Fisiopatología

S. aureus son una de las infecciones bacterianas más comunes en humanos y son los agentes causantes de múltiples infecciones humanas, incluyendo bacteriemia, endocarditis infecciosa, infecciones de piel y tejidos blandos (p. ej., impétigo, foliculitis, furúnculos, carbuncos, celulitis, síndrome de piel escaldada y otros) , osteomielitis, artritis séptica, infecciones por dispositivos protésicos, infecciones pulmonares (p. ej., neumonía y empiema), gastroenteritis, meningitis, síndrome de choque tóxico e infecciones del tracto urinario. [6] Dependiendo de las cepas involucradas y el sitio de infección, estas bacterias pueden causar infecciones invasivas y / o enfermedades mediadas por toxinas. [6] [7] & # x000a0 La fisiopatología varía mucho según el tipo de enfermedad. S. aureus infección. [6] Los mecanismos para la evasión de la respuesta inmune del huésped incluyen la producción de una cápsula antifagocítica, el secuestro de anticuerpos del huésped o el enmascaramiento del antígeno por la proteína A, la formación de biopelículas, la supervivencia intracelular y el bloqueo de la quimiotaxis de los leucocitos. [8] [7] & # x000a0 bacterias a proteínas de la matriz extracelular y la fibronectina en la endocarditis infecciosa está mediada por proteínas asociadas a la pared celular bacteriana, como las proteínas de unión al fibrinógeno, los factores de aglutinación y los ácidos teicoicos. [7] Además, los superantígenos estafilocócicos (TSST-1 o toxina 1 del síndrome de choque tóxico) son factores de virulencia importantes en la endocarditis infecciosa, la sepsis y el síndrome de choque tóxico. [9] [10] & # x000a0 Las infecciones por neumonía están asociadas con la producción bacteriana de PVL (Leucocidina de Panton-Valentine), proteína A y alfa-hemolisina, y las infecciones son más comunes después de la infección por el virus de la influenza, así como de un diagnóstico de fibrosis quística. S. aureus cepas para formar biopelículas y comunicarse mediante la detección de quórum de una manera dependiente de la densidad de células bacterianas. & # x000a0 [11]


Resultados

Extracción de matriz de C. acnes RT5

La biomasa promedio de la biopelícula fue de 1,5 cm 3 o 0,46 g después de una semana de incubación. Después de la extracción de la matriz y la ultracentrifugación, el sobrenadante que contenía la matriz se dividió en dos fases (Figura 1): una fase marrón (debido a las porfirinas), una fase superior sobrenadante transparente (SUP) y una fase inferior sobrenadante turbia (SLP). La división del SUP y SLP fue únicamente el resultado del protocolo de extracción de la matriz y no se asoció con la estructura espacial de la matriz del biofilm. en vivo. La DO media540 de las fases superior e inferior fue 0,1 y 1,2, respectivamente. El volumen promedio fue 12 & # x00B1 0.5 mL para el SUP y 3 & # x00B1 0.5 mL para el SLP. Realizamos el análisis bioquímico cuantitativo, análisis proteómico y SERS para el SUP y SLP por separado debido a diferencias en su composición. Para el análisis bioquímico cuantitativo, también analizamos el sobrenadante total de la matriz (TMS). Los cálculos de TMS se basaron en los volúmenes y concentraciones de los compuestos en cada fase.

Figura 1. Ultracentrifugación de preparados C. acnes Biofilm RT5 extracción de biomasa y matriz. (Izquierda) Formación de gradientes e inoculación de la biomasa sonicada. (Derecha) Aspecto típico de las dos fases de la matriz tras la ultracentrifugación. Los números 1, 2, 3 y 4 se refieren a las soluciones de CsCl como se indica en la Tabla 1.

La medición de la actividad LDH mostró la DO490 de formazán en aproximadamente 0,05 tanto para SUP como para SLP. El OD490 para las muestras de control de bacterias intactas fue 0, mientras que alcanzó 0,1 en suspensiones bacterianas tratadas con tampón de lisis. La actividad LDH medida más alta se obtuvo en muestras de biomasa después de la ultracentrifugación sin tratamiento adicional (intacta), mientras que la DO540 de las suspensiones fue 1,0. El OD490 de formazán fue de aproximadamente 1,5 para las mismas muestras. Esto muestra que la actividad LDH basal de C. acnes RT5 es bajo. Durante el crecimiento de la biopelícula, una pequeña parte de la población celular muere continuamente y su contenido se difunde en la matriz, lo que explica la pequeña cantidad de LDH detectada en las muestras de la matriz.

los C. acnes Las células RT5 se trataron con varios agentes líticos (Tabla 2) para verificar que las bacterias no sufrieran daños críticos durante la preparación de la matriz. En todos los casos, el OD490 medida en el ensayo de LDH fue de aproximadamente 0,1, lo que indica que las membranas de C. acnes no se dañaron incluso después de la exposición a lisozima y ultrasonido. Además, los agregados celulares no se dispersaron, como se observó por microscopía óptica (Figuras 2A y # x2013C), excepto después de la exposición a las condiciones más duras (lisozima + ultrasonido + perlas de vidrio) (Figura 2E). Los agregados celulares también se dispersaron parcialmente si las bacterias se expusieron a una combinación de lisozima de 1 mg / ml y ultrasonido, pero sin perlas de vidrio (Figura 2D).

Figura 2. Microscopía óptica de C. acnes Suspensiones de células RT5 tratadas según varios protocolos líticos. (A) Células intactas (control). (B) Tampón de lisis a temperatura ambiente (RT). (C) Lisozima (0,01 mg / ml) + tampón de lisis a 37ºC. (D) Lisozima (1 mg / mL) + tampón de lisis + ultrasonido. (MI) Lisozima (2 mg / mL) + tampón de lisis + ultrasonido en presencia de perlas de vidrio. Consulte la Tabla 2 para obtener más detalles.

Análisis bioquímico cuantitativo de los componentes básicos de la matriz de C. acnes Biopelículas RT5

Cuantificamos la proporción de la base C. acnes Componentes de la matriz RT5 extraídos por nuestro método utilizando métodos bioquímicos. No calculamos la masa seca de la matriz por varias razones. La presencia de CsCl en las soluciones hizo imposible determinar el peso seco de la matriz, y el uso de bolsas de diálisis, incluso con el tamaño de poro más pequeño, probablemente condujo a la pérdida de materia orgánica [especialmente de bajo peso molecular (LMW ) compuestos]. Las variaciones de los volúmenes de fase fueron pequeñas. Por lo tanto, primero calculamos la cantidad de componentes de la matriz como mg / mL de volumen de líquido y luego & # x03BCg / mg de masa de biopelícula.

Los cálculos se basaron en el contenido de carbono orgánico total y los resultados se resumen en la Tabla 3. La masa total de carbono orgánico en la matriz de biopelícula extraída fue aproximadamente 31,5 mg o 68,47 & # x03BCg / mg de biomasa de biopelícula seca. La concentración de carbono orgánico fue más del doble en el SUP que en el SLP, probablemente debido a la presencia de altas cantidades de compuestos orgánicos de BPM (pigmentos y metabolitos). El SLP estaba formado principalmente por moléculas de alto peso molecular (HMW) (proteínas y ADN) y no contenía tanto pigmento como el SUP.

Tabla 3. Composición de la materia orgánica del extraído C. acnes Matriz de biopelícula RT5.

Calculamos la proporción promedio de carbono en la masa molecular para cada componente de la matriz. Para los carbohidratos, la proporción de carbono en la glucosa corresponde al 40% de la masa molecular, y para las proteínas, es del 45% en base a la proporción de carbono en BSA. Para el ADN, usamos una proporción promedio de carbono en 100 pb de C. acnes ADN, considerando una relación de pares G & # x2013C de aproximadamente 60% (Brzuszkiewicz et al., 2011). Esto llevó a un valor del 32%. Los carbohidratos fueron el componente más abundante en la matriz para ambas fases, especialmente la SUP. La concentración de azúcares reductores fue significativamente menor en el SLP, probablemente debido a su peso molecular y distribución en el gradiente de CsCl. Los polisacáridos representaron generalmente más del 60% del material orgánico en el TMS.

El segundo componente más abundante de la C. acnes La matriz RT5 era proteína. Aquí, la situación era opuesta a la de los polisacáridos. La concentración de proteína fue aproximadamente dos veces menor en el SUP que en el SLP. Aunque las proteínas HMW fueron probablemente más abundantes en el SLP que en el SUP, su cantidad total fue menor que la de las proteínas LMW debido a las diferencias de volumen (un promedio de 3 mL SLP versus 12 mL SUP). La masa total calculada de proteína de la matriz extraída fue aproximadamente 26,67 & # x03BCg / mg de biomasa de biopelícula seca.

El ADN fue el polímero con la concentración más baja en la matriz extraída. Su concentración en el SUP fue dos veces menor que en el SLP. Calculamos que la relación de las moléculas de ADN de LMW a HMW en la matriz era 2: 1, en función de su distribución espacial en el gradiente de CsCl y las concentraciones en SUP y SLP. La masa total de ADN fue de aproximadamente 2,5 mg por 1,5 cm 3 de biomasa húmeda o 5,43 & # x03BCg / mg de biomasa de biopelícula seca. La baja concentración de ADN en la matriz muestra que nuestro método de extracción de matriz no dañó ni destruyó las células. De hecho, los experimentos de control realizados con la misma técnica sobre una biopelícula de 0,1 cm 3 de una cepa transformada de Escherichia coli ET12567 mostró que el único ADN obtenido fue el del plásmido pTetONCFPOpt (Sastalla et al., 2009) a una concentración de 100 & # x03BCg / mL del extracto (datos no mostrados).

Realizamos combustión húmeda y calculamos la proporción de todos los polímeros principales en el C. acnes Matriz RT5. Aproximadamente el 23,8% del carbono orgánico encontrado en el TSM no provenía de péptidos, azúcares o ADN, representando el 23,3% del carbono orgánico total en el SUP y el 26,5% en el SLP (Cuadro 3). Dado el metabolismo de C. acnes, es probable que estos compuestos representen varios metabolitos, que incluyen esencialmente porfirinas y sus precursores. De hecho, una reacción cualitativa mostró una gran cantidad de ácido & # x03B1-aminolevulínico (datos no mostrados).

Análisis proteómico de C. acnes Matriz RT5

Realizamos pruebas de Bradford para controlar la pérdida de proteínas en cada paso de la preparación para el análisis de Orbitrap. Antes de la diálisis, detectamos 19,5 & # x03BCg / mL de proteína en el SUP y 116,45 & # x03BCg / mL en el SLP. Después de la diálisis, el contenido de proteína del SUP fue de 14,3 y el del SLP fue de 61,0 & # x03BCg / mL, correspondiente a una masa de proteína de 28,57 y 305,19 & # x03BCg, respectivamente. Por tanto, hubo una alta pérdida de proteínas (& # x221247,6%) de la fase inferior durante la diálisis. Dado el diámetro de los poros de la membrana de diálisis, tal pérdida probablemente se debió a la de los péptidos de cadena muy corta.

Análisis proteómico Orbitrap del C. acnes La matriz de biopelícula RT5 mostró un total de más de 400 proteínas diferentes (consulte la Tabla complementaria S1). Muchas eran enzimas catalíticas involucradas en el metabolismo de azúcares, proteínas y nucleótidos. Muchas de las proteínas que se encuentran en el extracto de matriz eran componentes (dominios o monómeros) de estructuras moleculares más complejas, como ribosomas y citocromos. La presencia de muchas enzimas intracelulares puede explicarse por la autólisis celular normal que se produce durante la formación y maduración de la biopelícula. Lo mismo ocurrió con las proteínas no enzimáticas. En general, encontramos proteasas, nucleasas y enzimas involucradas en el procesamiento de carbohidratos y 48 proteínas hipotéticas con función desconocida. También encontramos 43 proteínas ribosomales en la matriz de la biopelícula (una es putativa).

Hubo ligeras diferencias en las 30 proteínas más abundantes encontradas en SUP y SLP, pero 22 fueron las mismas (Tabla complementaria S2). La proteína dominante de la C. acnes La matriz RT5 era chaperonina GroL, era la proteína más abundante tanto en SUP como en SLP. La chaperonina GroS también se encontraba entre las proteínas más abundantes, junto con la chaperona DnaK. Chaperonin GroL es un homólogo de la proteína Hspd1 de mamífero, que se ha anotado para unirse al ADN 1. En E. coli, esta proteína se encuentra normalmente en el citoplasma, pero también se puede encontrar en las membranas (Li y Young, 2012). La proteína HMPREF9571_00996, de función desconocida, fue la segunda proteína más abundante en el SUP y la quinta en el SLP. Cinco de las 30 proteínas más abundantes de la matriz no tienen función conocida. Pueden ser parte del componente estructural de la matriz de la biopelícula o realizar otras funciones.En el SUP estaba presente una proteína de la familia DoxX de 210 aminoácidos. Las proteínas de la familia DoxX incluyen proteínas transmembrana de función desconocida, probablemente implicadas en la regulación del equilibrio de sodio en las membranas axonales en eucariotas (Tran et al., 2010). Las funciones de las proteínas DoxX en C. acnes Las biopelículas RT5 no están claras. Los factores de elongación EF-Tu y EF-G también fueron abundantes tanto en SUP como en SLP. La presencia de EF-Tu, una proteína normalmente muy abundante en las células (Weijland et al., 1992) puede ser el resultado de la autólisis celular normal durante la formación de la biopelícula. Sin embargo, se ha informado recientemente que EF-Tu es una proteína del pluriempleo, que puede actuar como sensor de la sustancia P en bacterias Gram-positivas (Mijouin et al., 2013). Por lo tanto, estos factores también pueden desempeñar otro papel en las biopelículas. Lo mismo puede ser cierto para las enzimas de la glucólisis y las vías de fermentación del ácido propiónico, las proteínas ribosómicas, los dominios de los dominios de la ARN polimerasa, las ATP sintasas y otras enzimas (Tabla 4) que se encuentran entre las 30 proteínas más abundantes de la matriz. También se descubrió que la enolasa es una proteína abundante en un estudio anterior (Okuda et al., 2018), y su función en la matriz requiere más estudios.

Cuadro 4. Desplazamientos químicos de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1 H y 13 C (& # x03B4, ppm).

Los cambios químicos para NAc están en & # x03B4H 1,97 y 2,01, & # x03B4C 23,4 y 175,4 y 175,8 (para los residuos C y D, respectivamente) & # x03B4H 2.07, & # x03B4C 23,4 y 176,4 (para el residuo E). Además, encontramos tres proteínas de la familia DoxX (270, 210 y 133 aminoácidos de longitud) en el C. acnes matriz. También encontramos varias hidrolasas establecidas y putativas para varios sustratos, en particular dos celulasas, otra glicosil hidrolasa, hidrolasas de nucleótidos y una amidohidrolasa, que podrían desempeñar un papel en la formación de biopelículas y el consumo de sustrato durante la formación de biopelículas en la piel. En particular, la glicerofosfodiéster fosfodiesterasa, una enzima involucrada en el metabolismo de los lípidos, puede ser un factor importante en el establecimiento de C. acnes RT5 en la piel, así como su patogenicidad. Hidrolasa HAD putativa, que se encontró en el C. acnes La matriz RT5 también puede estar involucrada en la escisión de lípidos (Caparr & # x00F3s-Mart & # x00EDn et al., 2013), así como otra supuesta hidrolasa. Otras posibles hidrolasas que se encuentran en la matriz también pueden estar involucradas en el metabolismo de los lípidos (ver Tabla complementaria S1). Además de las hidrolasas, encontramos una serie de enzimas involucradas en varios procesos intracelulares en la matriz de C. acnes RT5: catabolismo de azúcares, transcripción y traducción, ciclo celular y síntesis de aminoácidos. También identificamos factores de transcripción de iniciación, alargamiento y terminación (consulte la Tabla complementaria S1). Finalmente, catalasa, peroxiredoxina y superóxido dismutasa (SOD) también estaban presentes en la matriz y pueden participar en la protección contra el estrés oxidativo.

También encontramos la supuesta proteína SagB asociada a la estreptolisina en la matriz de C. acnes RT5. SagB es una proteína de 343 aminoácidos. A modo de comparación, SagB de Streptococcus pyogenes (AF067649) contiene 316 aminoácidos 1. En el Estreptococo género, SagB es una ciclodehidrogenasa citoplasmática involucrada en el procesamiento de estreptolisina SagA utilizando mononucleótido de flavina como aceptor de electrones (Molloy et al., 2011). En C. acnes RT5, esta supuesta proteína probablemente esté involucrada en procesos similares del metabolismo de la hemolisina que son importantes para la patogenicidad. También encontramos al supuesto acompañante FliS en la fase inferior. Esta proteína participa en la síntesis de flagelos en varias bacterias móviles (Altegoer et al., 2018). El papel de un supuesto FliS en una bacteria inmóvil, como C. acnes, no está claro, pero podría tener otras funciones posiblemente directamente conectadas con la composición de la porción de proteína de la matriz de la biopelícula, porque requiere el plegamiento extracelular y la modificación posterior a la traducción. C. acnes normalmente contiene cinco factores de Christie, Atkins, Munch-Peterson (CAMP) (Valanne et al., 2005). No encontramos ningún factor CAMP en la matriz, sino proteínas muy similares a ellos. Por ejemplo, la proteína hipotética HMPREF9571_02536 comparte más del 99% de similitud con el factor CAMP-1 de otras cepas de C. acnes (según las bases de datos Uniprot 2 y NCBI 3). Consiste en una molécula de 285 aminoácidos con un peso molecular de 30,394 kDa.

Espectroscopia Raman de superficie mejorada del C. acnes Matriz de biopelícula RT5

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión de nanopartículas se muestran en la Figura 3. El análisis de los espectros SERS de la matriz aislada en comparación con la biomasa antes y después del aislamiento de la matriz mostró más de 40 picos principales (Figura 4).

Figura 3. Imagen de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de nanopartículas.

Figura 4. Espectros de dispersión Raman mejorados en la superficie (SERS) de la biomasa del biofilm y la matriz del biofilm de C. acnes RT5. 1 & # x2014 Fase superior de la matriz 2 & # x2014 Fase inferior de la matriz 3 & # x2014 Biomasa después de la eliminación de la matriz 4 & # x2014 Biomasa de biopelículas no tratadas.

Los espectros SERS registrados de C. acnes biopelículas y C. acnes las células separadas de la matriz mostraron varios picos (735, 964 y 1320 cm & # x22121) que son característicos de los espectros de muchos microorganismos (Kopitsyn et al., 2019). Los picos principales en los espectros de SERS de las células bacterianas corresponden a las oscilaciones de los grupos funcionales dentro de los complejos redox, como el NAD y el dinucleótido de flavina y adenina (FAD). En particular, el pico de 735 cm & # x22121 corresponde al estiramiento del ciclo de la adenina y el del pico de 964 cm & # x22121 para oscilar / estirar a lo largo del enlace N & # x2013C en adenina y guanina, y el de 1320 cm & # x22121 pico se observa en NAD + adsorbido en el electrodo de plata (Chen et al., 2002 Kairyte et al., 2012). Estos picos son característicos de las células microbianas y estaban ausentes de los espectros de la matriz separada.

Trazamos el espectro de cada muestra en un gráfico con un desplazamiento a lo largo del eje de ordenadas para evitar la superposición de los espectros. Las diferencias entre los espectros de la matriz aislada y la biomasa del biofilm sugieren una extracción exitosa de la matriz y no una suspensión de restos celulares después de los procedimientos de extracción. Mostramos que SERS se puede utilizar para verificar rápidamente la extracción exitosa de la matriz. Además, obtuvimos los espectros de biomasa total del biofilm y la matriz, que se agregarán a la base de datos de espectros de microorganismos y se utilizarán para identificar C. acnes en muestras y materiales biológicos complejos con la ayuda de SERS. SERS tiene las ventajas de una preparación de muestras muy sencilla y una rápida obtención de los resultados. Es, por tanto, una herramienta prometedora para la detección de bacterias. La espectroscopia SERS por sí misma también es una herramienta potencialmente poderosa para la detección de compuestos que generalmente están presentes normalmente en matrices de biopelículas bacterianas. Sin embargo, por supuesto, se necesita construir una imagen más completa usando una combinación de SERS con otros métodos. Hasta la fecha, el punto débil de SERS es la ausencia de una gran base de datos de espectros de polímeros orgánicos, lo que complica enormemente el análisis. El valor esencial de los datos actuales es una contribución a la formación de esta primera base de datos SERS de espectros bacterianos.

Análisis de polisacáridos

Analizamos tanto los carbohidratos de la matriz como de la pared celular para compararlos y generar una imagen lo más completa posible. Comenzamos primero con los azúcares de la pared celular. El polisacárido se aisló de células bacterianas desintegradas mediante extracción paso a paso con CCl al 10%.3CO2H, primero a 4 & # x00B0C durante 48 hy luego a 100 & # x00B0C durante 5 min. Los extractos fríos y calientes se dializaron, liofilizaron y purificaron por separado mediante cromatografía de permeación en gel (GPC) en TSK HW-40 (S). El análisis de azúcar por GLC de los acetatos de alditol reveló una composición similar de polisacáridos en ambos extractos, que contenían glucosa, galactosa, manosa y GalNAc. La configuración D de la glucosa se determinó mediante GLC del acetilado (S) -2-octilglicósidos (Leontein y L & # x00F6nngren, 1993). La configuración D de los otros monosacáridos constituyentes se determinó utilizando regularidades conocidas en los efectos de la glicosilación en los cambios químicos de 13C NMR (Shashkov et al., 1988), según lo resumido y calculado por el servicio de simulación GODDESS NMR (Kapaev y Toukach, 2015).

Los espectros de RMN de 1 H y 13 C de ambos extractos eran idénticos y mostraban señales de diferentes intensidades, lo que indica heterogeneidad estructural. Los extractos se combinaron y estudiaron mediante espectroscopía de RMN unidimensional (1D) y 2D.

La serie principal en el espectro de 13C NMR del polisacárido contenía señales para cinco carbonos anoméricos en & # x03B4 99.8 & # x2013102.7, tres HOCH2-C grupos (C-6 de Glc, Gal y GalN) en & # x03B4 62.5 & # x201369.3, cinco carbonos que contienen nitrógeno (C-2 y C-3 de 2 ManN3NA y C-2 de GalN) en & # x03B4 52.0 & # x201354.5, y otros carbonos del anillo de azúcar en la región & # x03B4 68.2 & # x201382.3, y norte-grupos acetilo (CH3 en & # x03B4 23.4, CO en & # x03B4 175.4 & # x2013176.4). Estos datos son consistentes con la composición de la PS determinada por análisis de azúcar. La ausencia de señales de la región de & # x03B4 83 & # x201388, característica de los furanósidos (Bock y Pedersen, 1983 Lipkind et al., 1988), muestra que todos los residuos de monosacáridos están en forma piranosídica. La serie principal en el espectro de RMN 1 H del polisacárido contenía señales para cinco protones anoméricos en & # x03B4 4.64 & # x20135.14, y otros protones de azúcar en la región & # x03B4 3.35 & # x20134.41, y norte-grupos acetilo en & # x03B4 1.97 & # x20132.07.

Las series principales en los espectros de RMN de 1 H y 13 C del polisacárido se asignaron siguiendo 2D 1 H, 1 H COSY, 1 H, 1 H TOCSY, 1 H, 1 H ROESY, 1 H, 13 C HSQC y 1 H , 13 experimentos C HMBC (Tabla 4 y Figura 5), ​​y sistemas de giro para cinco residuos de cada uno de Gal (A), Glc (B), ManNAc3NAcA (C), ManNAc3NAcA (D) y GalNAc (mi) fueron identificados. La asignación se basó en correlaciones de H-1 y H-2 a H-6 para Glc, H-1 a H-2 y H-3 a H-5 para ManNAc3NAcA, y H-1 a H-4 para Gal y GalNAc en el espectro TOCSY. La asignación dentro de cada sistema de giro se realizó usando COSY, y las configuraciones relativas de los monosacáridos se determinaron en base a 3 JS.S constantes de acoplamiento. Las señales H-6 para residuos de ManNAcA se encontraron mediante correlaciones H-5 / C-6 en el espectro HMBC.

Figura 5. Partes de un espectro de correlación cuántica única heteronuclear editado por multiplicidad 2D, 1 H, 13 C (edHSQC) del polisacárido. Las partes correspondientes de los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) de 1 H y 13 C se muestran a lo largo de los ejes horizontal y vertical, respectivamente. Los números se refieren a protones y los carbonos de las unidades de azúcar se designan con letras, como se muestra en la Tabla 4.

Posiciones de campo relativamente bajo de las señales C-5 en & # x03B4 72,9 & # x201376,2 en el espectro de 13C-NMR del polisacárido, en relación con los datos publicados para los correspondientes monosacáridos (Ranzinger et al., 2015 Toukach y Egorova, 2015), mostró que ManNAc3NAcA (C), ManNAc3NAcA (D) y GalNAc (mi) están enlazados con & # x03B2. Del mismo modo, la configuración & # x03B1 de Gal (A) y Glc (B) fue inferido por posiciones de campo relativamente alto de las señales C-5 en & # x03B4 71.5 & # x201372.3.

Posiciones de campo relativamente bajo de las señales para C-6 de Gal (A), C-6 de Glc (B), C-4 de ManNAc3NAcA (C, D) y C-4 de GalNAc (mi), en relación con sus posiciones en los correspondientes monosacáridos no sustituidos (Ranzinger et al., 2015 Toukach y Egorova, 2015), definieron las posiciones de sustitución de los monosacáridos en el polisacárido. Estos datos revelaron la estructura del polisacárido (Figura 6).

Figura 6. Estructura del polisacárido de la matriz y pared celular de C. acnes HA043PA2.

Según una búsqueda sistemática en la base de datos de estructuras de carbohidratos (Toukach y Egorova, 2016), esta estructura (CSDB ID 29100) se informó anteriormente para P. acnes (equivalente de C. acnes) cepa C7 (Nagaoka et al., 1985). En la matriz, tiene un peso molecular de al menos 12 kDa (debido al tamaño de los poros).

El análisis de los polisacáridos de la matriz mostró que el polisacárido dominante en la matriz es exactamente el mismo que el de la matriz. C. acnes pared celular. Además, no encontramos ninguna señal de PNAG. En cambio, encontramos norte-acetilgalactosamina y norte-acetilmanosamina. No encontramos residuos de 2-acetamido-2-desoxi-galactosa en el polisacárido, que es característico de PNAG. En su lugar, encontramos residuos de 2-acetamido-2-desoxi-galactosa y ácido 2,3-di-acetamido-2,3-didesoxi-manurónico.

Las señales de series menores no fueron asignadas debido a su baja intensidad.


Discusión

Durante los últimos 15 años, se ha planteado la hipótesis de que la degeneración del disco intervertebral y el dolor lumbar crónico que la acompaña pueden estar asociados, al menos en algunos casos, con una infección bacteriana subclínica crónica por PAG. acnes [dieciséis]. Un modelo animal descrito recientemente demuestra la capacidad de PAG. acnes para inducir la degeneración del disco [17, 18]. Sin embargo, en los datos de cultivos microbiológicos, la contaminación es difícil de excluir por completo, ya que PAG. acnes es un comensal cutáneo común. El estudio actual busca resolver este dilema a través de un protocolo mejorado para el cultivo bacteriano cuantitativo, en el lugar obtención de imágenes de tejido de disco resecado, y filotipificación molecular de PAG. acnes aislamientos.

En nuestro estudio anterior [6], fuimos los primeros en utilizar cultivo bacteriano cuantitativo para la detección de PAG. acnes en muestras de disco. Aquí abordamos varias debilidades: (i) pesar el tejido del disco antes de la homogeneización para permitir una determinación precisa de UFC / gramo, en lugar de un homogeneizado de UFC / ml (ii) utilizar un Stomacher 80 para la homogeneización del tejido del disco, en lugar de un mortero manual y maja (iii) aumentar el volumen de la siembra de 10 μl (usando un bucle) a 100 μl (usando una pipeta) y (iv) confirmación de la identidad bacteriana por MALDI-TOF MS, en lugar de pruebas bioquímicas. Estas mejoras pueden ayudar a facilitar un mayor nivel de estandarización en el futuro, proporcionando a los investigadores medios para la reproducibilidad y comparabilidad entre estudios. En particular, la inclusión de un paso de desmontaje de biopelícula, como la homogeneización de tejido mediante el uso de un Stomacher, es un componente que creemos que es crucial para que los cultivos reflejen con precisión la carga de tejido y eviten falsos negativos.

Con este protocolo de cultivo mejorado, buscamos confirmar la prevalencia de cultivos PAG. acnes observado en nuestro estudio anterior [6], esta vez con una población aún mayor de pacientes sometidos a microdiscectomía por hernia de disco lumbar. En comparación con este trabajo anterior, observamos una tasa de prevalencia ligeramente más baja de PAG. acnes (32% vs. 40%), lo que puede ser el resultado de la metodología mejorada y el uso principalmente de un Stomacher 80 que es menos vulnerable a introducir contaminación que el mortero, que se utilizó para la homogeneización del tejido del disco en nuestro estudio anterior. En general, ambos estudios están de acuerdo con la mayoría de publicaciones anteriores que describen PAG. acnes como la especie más frecuentemente aislada del tejido del disco lumbar por cultivo anaeróbico, incluyendo Stirling et al. (44%) [9], Arndt et al. (35%) [4] y Albert et al. (40%).

Los recuentos de colonias observados en el 119 PAG. acnes las muestras positivas variaron significativamente, de 12 a 20952 UFC / gramo (mediana = 350 UFC / gramo). Aunque uno podría esperar que cierto Las infecciones se asocian con mayor probabilidad con recuentos de colonias más altos, buscamos proporcionar una confirmación visual directa de PAG. acnes biopelícula. Seleccionamos 103 UFC / g como umbral de positividad para intentar la microscopía de fluorescencia, aunque las muestras con recuentos bacterianos más bajos ciertamente también podrían incluir verdaderos positivos (Tabla 2). Hasta donde sabemos, este estudio representa la primera reconstrucción tridimensional de una biopelícula de disco intervertebral mediante el uso de CSLM, así como la confirmación directa de PAG. acnes biopelícula por FISH específico del organismo (Fig. 2 y Fig. 3) [19].

Incluso con una carga tisular de 103 UFC / g, la identificación de organismos en la sección histológica representa un desafío distinto, ya que pueden evadir fácilmente la detección visual a este nivel. Nuestra capacidad para observar biopelículas en 7/8 muestras sugiere que la carga bacteriana real puede exceder los valores medidos de UFC / g, incluso con el paso de desmontaje de la biopelícula. Es importante tener en cuenta que, a menos que un paso de homogeneización disperse una biopelícula por completo en organismos individuales (muy poco probable), una medida de UFC / g será menor que el valor real de organismo / gramo. De hecho, los recuentos de colonias podrían subestimar aún más la en el lugar Carga bacteriana si la biopelícula contiene una mezcla de organismos viables y no viables (que las observaciones histológicas no pueden evaluar). En cualquier caso, nuestros hallazgos destacan la necesidad de procedimientos de laboratorio que tengan en cuenta el modo de crecimiento de la biopelícula. Debido a que las muestras de disco se crioincrustaron como fragmentos intactos, se esperaría que la contaminación se limitara a las superficies de las muestras. En cambio, se observaron bacterias en el interior de los bloques congelados. Esta distribución de PAG. acnes dentro del cuerpo del fragmento de disco intervertebral proporciona una fuerte evidencia contra la contaminación de la piel o del entorno externo. Dado que la sensibilidad de FISH es menor que la tinción de ADN con SYTO, no es de extrañar que con respecto a los casos 3 y 10 no hayamos confirmado la biopelícula observada con la tinción de ADN por FISH.

Además, aplicamos el esquema de phylotyping MLST8 que distingue entre PAG. acnes cepas clásicamente asociadas con inflamación / acné y aquellas asociadas con colonización cutánea benigna —o quizás incluso beneficiosa— [20]. Tipo IA1 se encuentra comúnmente en abundancia en la piel inflamada, mientras que el tipo II generalmente se asocia con sangre, infecciones endodónticas y piel normal [20]. Centrándonos en las cepas cultivadas en alta densidad (& gt1000 UFC / g), observamos una distribución de filotipos en lugar de un predominio único. Los resultados de este estudio son similares a los de Rolasson et. Alabama. [21], quien (a través de un solo locus recA análisis) observó que el 50% de los discos aislados pertenecían al filotipo II (34% aquí) y el 42% al filotipo IA1 (39% aquí) [9]. Por el contrario, mientras que nuestro estudio detectó un 24% de filotipo IB, Rolasson et.Alabama. observado sólo el 9%. Juntos, estos estudios sugieren que ningún PAG. acnes El filotipo es más propenso a la infección del disco, aunque la caracterización continua de los aislados de disco proporcionará una distribución del filotipo más detallada.

Finalmente, evaluamos asociaciones potenciales entre PAG. acnes la positividad del cultivo y los parámetros clínicos de los pacientes estudiados. De acuerdo con nuestro estudio anterior [6], los pacientes con PAG. acnes los cultivos positivos fueron más jóvenes que los pacientes con cultivo negativo. Una explicación de estos hallazgos es que PAG. acnes podría acelerar los síntomas degenerativos y asociados del disco relacionados con la edad. Además, observamos una prevalencia significativamente mayor de PAG. acnes en especímenes de discos de machos, un hallazgo cuya importancia aún no se ha dilucidado. Desde una perspectiva de utilidad clínica y resultados, las puntuaciones de dolor prequirúrgico no discriminaron entre PAG. acnes positivo y PAG. acnes pacientes negativos. Sin embargo, las puntuaciones de los resultados a largo plazo informados por los pacientes posquirúrgicos pueden proporcionar más información a este respecto.

En general, una de las implicaciones más significativas de nuestros hallazgos es la forma en que desafían los paradigmas tradicionales de infección (típicamente inflamatorio y patológico) versus colonización (no inflamatorio y fisiológico). Los discos intervertebrales se ven tradicionalmente como espacios estériles, por lo que la presencia de bacterias viables (1) representa un proceso no fisiológico o (2) redefine los límites anatómicos del microbioma humano normal. La asociación de estos organismos con la hernia de disco, ya sea como un evento aguas arriba o aguas abajo, sugiere lo primero. Si bien los organismos no parecen inducir un infiltrado leucocítico, la pregunta crítica que enfrentan los médicos sigue sin resolverse: ¿podrían contribuir de otra manera a los síntomas de dolor del dolor lumbar crónico?

Un hallazgo adicional digno de mención del estudio actual, así como de publicaciones anteriores [1-11], fue el aislamiento de bacterias Gram-positivas distintas de PAG. acnes, específicamente Estafilococos de los discos resecados. Aunque no está estrechamente relacionado filogenéticamente, PAG. acnes y Estafilococos comparten ciertos rasgos funcionales, como su capacidad para colonizar la piel y la propensión de varias especies / cepas a formar biopelículas [22]. En nuestro estudio de 368 pacientes cultivamos PAG. acnes en 119 casos y Estafilococos en 61 casos totales. De los 8 casos de Estafilococos con recuentos de colonias ≥ 1000 UFC / g no Estafilococos especies aparecieron más de dos veces. Por otra parte, PAG. acnes con recuentos de colonias ≥ 1000 UFC / g se aisló en 38 casos. Por tanto, concluimos que PAG. acnes es la única especie significativa cultivada del disco.

El estudio actual tiene varias limitaciones que podrían abordarse en trabajos futuros. Aunque realizamos la tipificación MLST8 de los aislamientos, puede ser necesaria una secuenciación de mayor resolución de cepas adicionales para determinar si algún clado distinto (u otros determinantes genéticos) está asociado con la colonización / infección del disco. PAG. acnes puebla varios nichos cutáneos, pero también puede colonizar la mucosa respiratoria superior, el tracto gastrointestinal, la conjuntiva y el conducto auditivo externo. Asimismo, el organismo se asocia con infecciones asociadas a dispositivos, cáncer de próstata y sarcoidosis [23]. Sin embargo, aunque 119 genomas de PAG. acnes están disponibles actualmente en Genbank [24, 25], un gran predominio representan los aislados de piel. Como resultado, los métodos moleculares para el filotipo PAG. acnes las cepas están potencialmente sesgadas y podrían subestimar la diversidad de cepas de otros sitios del cuerpo. En este sentido, la secuenciación adicional de los aislados de disco podría proporcionar una visión general de la estructura de la población de la especie.

Desde una perspectiva clínica, nuestro estudio solo recopiló puntuaciones de dolor preoperatorio. Para evaluar la utilidad clínica potencial, los estudios que analizan las puntuaciones de dolor tanto preoperatorias como posquirúrgicas en relación con PAG. acnes deben realizarse recuentos (UFC / g). Además, los estudios en pacientes que se someten a una segunda cirugía de disco, debido al fracaso de su primer procedimiento, podrían respaldar la posible utilidad clínica de PAG. acnes detección. En este subconjunto de pacientes, sería útil comparar datos cuantitativos entre los procedimientos, especialmente si UFC / go otros valores moleculares fueran más altos para la segunda cirugía. Para la población más amplia de pacientes que experimentan dolor lumbar crónico [26, 27], será importante determinar si PAG. acnes es exclusivo de la porción herniada del tejido del disco (I.mi., en ubicaciones específicas dentro de un disco) o distribuidos por todo el disco. Un estudio que utilice tejido de disco de cirugías de fusión espinal podría proporcionar la información necesaria.

El párrafo anterior también alude a una limitación inherente de la estrategia de investigación subyacente a nuestro manuscrito, que debe entenderse para no sacar conclusiones que actualmente no están respaldadas por nuestros datos. Hemos estudiado el material del disco de pacientes sometidos a cirugía de disco lumbar debido a un tratamiento conservador fallido o debido a déficits motores clínicamente relevantes. Hacerlo nos permitió realizar un estudio epidemiológico a gran escala sin requerir que los voluntarios se sometieran a un procedimiento de investigación.

La cirugía descompresiva para el núcleo pulposo herniado generalmente se dirige a los síntomas radiculares (parálisis, dolor neuropático intratable) y no al dolor lumbar, aunque el dolor lumbar puede ser un componente menor de las quejas generales de estos pacientes. El éxito inmediato y a corto plazo de la cirugía de disco se mide por el alivio de estos síntomas radiculares y si un subconjunto de estos pacientes progresa para convertirse en pacientes con dolor lumbar crónico (CLBP), normalmente no se encuentra en el seguimiento inmediato. Entonces, en esencia, nuestros hallazgos brindan un informe de situación epidemiológica en un grupo selectivo de adultos de mediana edad con consecuencias específicas de la enfermedad degenerativa del disco (DDD) que no son necesariamente representativas de la población en general y, muy probablemente, no del típico paciente con CLBP o el paciente de cirugía de espalda fallida / paciente de fusión fallida.

Por lo tanto, sería prematuro, sobre la base de nuestros datos actuales, afirmar que existe un vínculo directo entre las infecciones de disco de bajo grado con P. acnes y CLBP o la cirugía de artrodesis lumbar fallida, a pesar de que cada vez hay más literatura que apunta a que dirección [28-30].

P. acnes se comporta de manera bastante diferente a la mayoría de los demás patógenos bacterianos. En contraste con las infecciones piógenas rápidamente progresivas que resultan en condiciones severamente sépticas, las infecciones por P. acnes tienden a resultar en infecciones lentas y de bajo grado [31-34]. El germen también se ha relacionado con enfermedades que conllevan aspectos inmunológicos como el síndrome SAPHO y la sarcoidosis [35-42]. P. acnes puede, en determinadas situaciones, convertirse en un agente infeccioso intracelular que puede sobrevivir e incluso viajar dentro de los macrófagos humanos [43, 44]. En este momento, aunque los hallazgos son sugerentes, no podemos ni recomendamos que todos los pacientes sometidos a discectomía envíen material de disco para cultivo, ya que los cultivos de laboratorio de rutina actuales pueden no ser suficientes para indicar una infección. Además, hasta que se realicen los ensayos, no recomendamos que se necesiten antibióticos. Otras evaluaciones pueden identificar subconjuntos de individuos en los que estos dos puntos podrían considerarse.

En conclusión, este representa el estudio más grande hasta la fecha que demuestra una alta prevalencia de PAG. acnes en el tejido del disco de pacientes sometidos a microdiscectomía. Además, proporciona la primera evidencia microscópica de PAG. acnes biopelícula en el tejido del disco de la columna lumbar resecado. Todavía es posible que, entre PAG. acnes muestras con cultivo positivo, algunas originadas por contaminación perioperatoria. Sin embargo, dadas las muestras con una alta carga de organismos y la evidencia microscópica de biopelículas, llegamos a la conclusión de que al menos un subconjunto de discos intervertebrales herniados realmente se pobla con PAG. acnes.


Conclusión

La piel es el órgano más grande del cuerpo humano y forma una inmensa interfaz entre el huésped y su entorno. Como tal, constituye un sitio importante de interacciones entre el sistema inmunológico y sus habitantes microbianos. Estudios recientes han establecido el vínculo entre el desarrollo del sistema inmunológico residente de la piel y la microbiota cutánea y han demostrado un contacto directo entre los dos (revisado en Belkaid y Segre 77).

Varias especies bacterianas aisladas de la piel humana han demostrado su capacidad para formar biopelículas tanto in vitro como in vivo. En su estado de biopelícula, las bacterias presentan funciones metabólicas y fisiológicas diferenciales que a menudo las vuelven más virulentas y resistentes a los antibióticos. En este estado, pueden estar implicados en la etiología y exacerbación de los trastornos cutáneos. Dichos estudios, en combinación con técnicas de secuenciación independientes del cultivo, están comenzando a descubrir la complejidad del microbioma de la piel y sus funciones en relación con los trastornos cutáneos comunes. En consecuencia, los trastornos de la piel que se consideraban clásicamente como no infecciosos pueden llegar a incluir un componente infeccioso o estar afectados por uno o más agentes microbianos.

Clásicamente, la investigación sobre la participación de las biopelículas bacterianas en las enfermedades de la piel se había concentrado principalmente en las heridas crónicas, donde la presencia de las biopelículas se ha relacionado con el desarrollo de heridas, las infecciones y la cicatrización deficiente. Además, el papel de la detección de quórum, o la comunicación célula-célula bacteriana, un regulador importante de la formación de biopelículas, se ha expuesto parcialmente en relación con las infecciones bacterianas. 78 Se han informado pruebas directas que vinculan el alcance de la carga microbiana y la presencia de biopelículas con la gravedad y el pronóstico de las heridas crónicas, pero fueron limitadas debido a la dependencia de los estudios en técnicas basadas en cultivos, lo que resultó en una baja representación de la diversidad de especies y reflejos de la naturaleza de la colonización microbiana. 79 Los estudios modernos sobre heridas crónicas han intentado superar estas limitaciones mediante el uso de la secuenciación del ARNr 16S para el análisis de la comunidad bacteriana. 80,81 A pesar de que dichos estudios se han complicado e influenciado por los diferentes métodos de muestreo, la gran variabilidad de las heridas y el estado clínico de los pacientes79, han contribuido a una mejor comprensión de las heridas crónicas y han demostrado la importancia de biopelículas microbianas en el desarrollo de heridas y sus implicaciones para el cuidado y la recuperación de heridas. En esta revisión, nos hemos centrado en el papel de las biopelículas en los trastornos de la piel que se consideran no infecciosos y no se manifiestan como heridas cutáneas abiertas. En este contexto, hemos utilizado dos trastornos cutáneos comunes como ilustraciones de la importancia de estudiar la participación de las biopelículas para descubrir aspectos de la patogenia de los trastornos cutáneos. La evidencia de tal participación, aunque todavía limitada, destaca el potencial en el estudio de la relación entre la aparición y el desarrollo de biopelículas y la etiología y / o exacerbación de las enfermedades de la piel. Se ha informado de alguna evidencia limitada de la participación de biopelículas para trastornos cutáneos adicionales como impétigo bulloso, furúnculo y pénfigo foliáceo. 26,82 Dichos informes demuestran además que los microorganismos pueden desarrollar biopelículas que pueden crecer y persistir en las superficies y apéndices de la piel, lo que requiere más investigaciones.

Las bacterias asociadas a la piel han evolucionado para crecer en nichos específicos de la piel, y sus mecanismos de adhesión, supervivencia y propagación en la piel solo se comprenden parcialmente. 83 Los posibles estudios futuros deberían incluir la medición de la expresión de genes relacionados con la biopelícula en lesiones enfermas y / o el uso de métodos proteómicos para caracterizar las biopelículas microbianas en la piel. Además, los efectos de las toxinas, metabolitos y otros compuestos secretados por las biopelículas microbianas deben investigarse con respecto a las respuestas que invocan en los queratinocitos o inmunocitos de la piel. Por último, inducir el crecimiento de biopelículas en modelos de piel ex vivo o in vivo, y posteriormente perfilar las adaptaciones fisiológicas y moleculares llevadas a cabo tanto por el órgano como por el microbio, puede mejorar nuestra comprensión de la relación piel-biopelícula y potencialmente conducir al desarrollo de nuevas terapias. .


Resultados

Aislamientos de tejido profundo de P. acnes producir biopelícula

Comparamos la formación de biopelículas en una colección de 45 aislamientos de infecciones clínicas con la de una colección de 48 aislamientos de la piel de la frente de individuos sanos. Los aislamientos clínicos fueron principalmente de infecciones de prótesis articulares u otro material extraño relacionado con la cirugía y se recolectaron en tres departamentos de microbiología clínica diferentes en Suecia (ver Tablas 1 y 2 para más detalles). La formación de biopelículas se determinó, para cada aislado, midiendo la cantidad de cristal violeta absorbido por las bacterias en una biopelícula formada sobre plástico de poliestireno. En primer lugar, se evaluó la cantidad de formación de biopelículas de cinco aislamientos en diferentes medios de cultivo bacterianos. La formación de biopelículas fue mayor en medio BHI suplementado con glucosa que en BHI. La formación de biopelículas en un medio con triptona, levadura y glucosa fue aproximadamente el 50% de la de BHI, mientras que la formación de biopelículas en el caldo Todd-Hewitt con Tween-80 (0,1%) fue mucho menor (datos no mostrados). Por tanto, para experimentos adicionales, se utilizó medio BHI suplementado con glucosa. La reducción del inóculo inicial resultó en una menor formación de biopelícula después de 72 h. Después de 24 h de incubación, no se observó biofilm y, por lo tanto, se determinó la formación de biofilm de tres aislamientos después de 48, 72 y 96 h. Además, el número de bacterias dentro de la biopelícula se determinó mediante placa, y los resultados se muestran en la Fig. 1. La placa de bacterias de la biopelícula también mostró que no estaban presentes bacterias contaminantes. A las 72 h, la biopelícula era estable y el número de bacterias cultivables era alto, por lo que se procedió a la incubación de 72 h. La cantidad de bacterias en la biopelícula necesarias para producir una DO550 nanómetro de 1 después de 72 h de incubación fue de 6,4 × 10 7 a 1,8 × 10 8.

Aislar Sitio de aislamiento Departamento Escribe Absorbancia a 550 nm
AD1 Prótesis de rodilla L I A 1.8
AD2 Alambre esternal L I A 3.8
AD3 Alambre esternal L IB 1.5
AD4 Prótesis de rodilla L I A 0.95
AD5 Tejido óseo, cadera L I A 4.5
AD6 Tejido óseo, dedo L I A 1.7
AD7 Prótesis de rodilla L II 6.1
AD8 Prótesis de cadera L I A 1.5
AD9 Prótesis de cadera L I A 5.0
AD10 Tejido óseo, cráneo L II 11
AD11 Prótesis de cadera L I A 1.3
AD12 Prótesis de cadera L IB 0.96
AD13 Alambre esternal L II 1.8
AD14 Tejido óseo, fémur L II 1.4
AD15 dispositivo protésico, vértebra L I A 4.4
AD16 Tejido óseo, cráneo L II 2.9
AD17 Prótesis de cadera Ö I A 2.4
AD18 Prótesis de cadera Ö II 1.3
AD19 Prótesis de cadera Ö I A 1.5
AD20 Prótesis de rodilla Ö II 1.5
AD21 Prótesis de rodilla Ö II 0.36
AD22 Prótesis de cadera Ö I A 1.6
AD23 Prótesis de rodilla Ö I A 2.6
AD24 Prótesis de rodilla Ö II 1.5
AD25 Prótesis de cadera Ö I A 2.1
AD26 Prótesis de cadera Ö IB 5.5
AD27 Prótesis de cadera Ö IB 1.4
AD28 Prótesis de cadera Ö I A 0.61
AD29 Prótesis de cadera Ö I A 0.73
AD30 Prótesis de cadera Ö I A 4.2
AD31 Dispositivo protésico, vértebra Ö II 8.7
AD33 Prótesis de rodilla METRO IB 6.1
AD35 Dispositivo protésico, vértebra METRO I A 2.2
AD36 dispositivo protésico, vértebra METRO I A 3.2
AD38 Alambre esternal Ö I A 2.1
AD39 Alambre esternal Ö IB 1.8
AD40 Alambre esternal Ö I A 1.7
AD41 Alambre esternal Ö I A 1.5
AD42 Alambre esternal Ö I A 1.2
AD43 Alambre esternal Ö IB 0.53
AD44 Prótesis de rodilla Ö I A 0.99
AD45 Prótesis de fémur Ö I A 1.3
AD47 Prótesis de cadera Ö I A 3.3
AD48 Dispositivo protésico, vértebra Ö I A 1.6
AD49 Tejido óseo, cráneo L II 4.3
Aislar Escribe Absorbancia a 550 nm
AS1 IB 0.49
AS2 I A 0.63
AS3 IB 0.38
AS4 I A 0.70
AS5 I A 0.49
AS6 I A 0.66
AS7 I A 0.37
AS8 II 0.38
AS9 II 0.48
AS10 I A 0.32
AS11 IB 0.56
AS12 II 0.96
AS13 IB 1.2
AS14 I A 0.56
AS16 IB 0.51
AS18 IB 0.43
AS20 II 0.39
AS21 II 1.4
AS22 II 0.60
AS23 IB 0.88
AS24 I A 0.57
AS25 I A 0.62
AS26 I A 0.40
AS27 I A 1.1
AS28 II 0.55
AS29 II 0.64
AS30 I A 0.31
AS31 I A 0.55
AS32 I A 0.14
AS33 I A 0.09
AS34 I A 0.24
AS35 I A 0.13
AS37 IB 0.03
AS38 IB 0.29
AS39 II 0.41
AS40 II 0.32
AS41 II 0.23
AS42 II 0.30
AS43 II 0.24
AS44 I A 0.42
AS45 I A 1.3
AS46 IB 0.12
AS47 I A 1.9
AS48 I A 0.14
AS49 IB 0.65
AS50 I A 0.30
AS51 I A 0.12
AS52 II 0.44

La formación de biopelículas en plástico de poliestireno expresada como absorbancia a 550 nm por los aislados AD1 (♦), AD19 () y AD49 (?) Después de diferentes puntos de tiempo se muestra mediante las líneas rellenas y el eje izquierdo del gráfico. El número de UFC por pozo se determinó en los mismos puntos de tiempo y se indica mediante la línea de puntos y el eje derecho del gráfico.

Cada aislado se probó por triplicado en tres ocasiones diferentes y se calculó la absorbancia media para cada aislado. Los aislamientos de infecciones clínicas (aislamientos profundos) produjeron una mayor cantidad de biopelícula que los aislamientos de la piel de controles sanos (Fig. 2). A partir de los datos de la Fig. 2, se puede sospechar un sesgo positivo potencial en la distribución de la absorbancia, por lo que se procedió a utilizar estadísticas no paramétricas. La mediana de absorbancia fue 0,43 (0,14–1,0) para los aislados superficiales y 1,8 (0,95–5,3) para los aislados profundos (el rango se da como percentil 10 a 90). La diferencia es estadísticamente significativa (p & lt0,001). La mediana de absorbancia del control positivo para CoNS fue de 2,5 (2,2-4,8). El coeficiente de variación intra-experimental fue 53% (29-91%) para aislamientos superficiales y 32% (11-67%) para aislamientos profundos, mientras que el coeficiente de variación inter-experimental fue 83% (29-142%) para aislamientos superficiales y 39% (12-70%) para aislamientos profundos (mediana y rango del percentil 10 al 90).

Diagrama de caja que representa la formación de biopelículas por profundidad (AD) y superficial (AS) Propionibacterium acnes aislamientos en plástico de poliestireno expresados ​​como absorbancia a 550 nm. Cada valor es la media de tres experimentos separados, cada uno con muestras por triplicado. Dos valores están por encima de seis (8,7 y 11) y están representados por puntos en la línea exterior del diagrama. Las barras representan el percentil 10 al 90, los cuadros representan el percentil 25 al 75 y la línea dentro del cuadro representa la mediana. La diferencia entre los grupos es estadísticamente significativa (p & lt0,001).

Un límite de corte posterior al análisis para clasificar los aislamientos como biofilm positivo o biofilm negativo se estableció tentativamente en OD.550 nanómetro = 0,9.Si el fenotipo de biopelícula, tal como se define en este punto de corte, se utiliza para distinguir entre aislamientos profundos y superficiales, la sensibilidad de detección de un aislado profundo por determinación de biopelícula es del 91% y la especificidad es del 87%.

Falta de correlación entre P. acnes tipo y sitio de infección

Escribiendo de P. acnes tradicionalmente se ha realizado utilizando métodos serológicos pero, recientemente, se han aplicado métodos de genética molecular [18]. Primero empleamos un método basado en PCR [17], con resultados ambiguos, y luego procedimos a realizar la determinación de la secuencia de recA, que se ha descrito recientemente que tiene un tipo de secuencia que define el polimorfismo [18]. La distribución de tipos se muestra en la Fig. 3 es similar entre aislamientos profundos y superficiales. Además, probamos si el tipo se correlaciona con la formación de biopelículas. No se encontró tal correlación, y cada tipo contenía aislamientos que eran productores fuertes de biopelículas, así como aislamientos que eran productores débiles (ver Tablas 1 y 2).

Distribución de los tipos Ia, Ib y II (%), determinada por secuenciación de recA, de Propionibacterium acnes aislamientos aislados de infecciones profundas (EA) y piel (EA).

Aparición de biopelícula

La aparición de la biopelícula formada por el aislado AD49 sobre el plástico de poliestireno se investigó mediante SEM. Como control, se inmovilizaron bacterias del mismo aislado en fase de crecimiento planctónico y se sometieron a SEM.

La Fig. 4 muestra que la biopelícula incrusta las bacterias en una capa de aproximadamente 10 μm de espesor. De manera similar, la biopelícula del aislado AD49 se analizó mediante microscopía electrónica de transmisión y se comparó con la de las bacterias del mismo aislado sedimentadas del medio de crecimiento en su fase de crecimiento planctónico. Como se ve en la Fig. 5, la biopelícula se compone de estructuras tanto amorfas como fibrilares.

Micrografías electrónicas de barrido de biopelículas de Propionibacterium acnes Los aislamientos AD49 formados sobre plástico se muestran en (a) y (b). En (c) y (d) se muestran micrografías electrónicas de barrido del mismo aislado en la fase de crecimiento planctónico. Las barras de escala representan 10 μm (ayc) y 5 μm (by d).

En (a) y (b) se muestran micrografías electrónicas de transmisión de biopelícula formada en plástico por el aislado AD49. En (c) y (d) se muestran micrografías electrónicas de transmisión del mismo aislado en la fase de crecimiento planctónico. Las flechas marcan estructuras de biopelículas putativas. La barra de escala representa 500 nm.

Para adaptar el modelo más a la en vivo En esta situación, se permitió que varios aislamientos formaran una biopelícula en una perla de cemento óseo cultivando los aislamientos durante 72 h en presencia de la perla. La superficie de la perla se visualizó mediante SEM y se observó una biopelícula amorfa que cubría e incrustaba las bacterias (Fig. 6). La perla, incubada en medio solo, sirvió como control (Fig. 6).

En (a) y (b) se muestran micrografías electrónicas de barrido de un cordón de cemento óseo con dos aumentos diferentes. En (c) y (d), se muestra la biopelícula formada por el aislamiento AD39 en otra perla de cemento con los mismos aumentos. La flecha indica biopelícula. La barra de escala en (c) representa 100 μm (a, c) y la de (d) representa 10 μm (b, d).

El plasma inhibe la formación de biopelículas al P. acnes

Para muchas otras especies bacterianas, la formación de biopelículas se ve facilitada por la presencia de plasma y, por lo tanto, el efecto del plasma sobre P. acnes Se determinó la formación de biopelículas. Sorprendentemente, la presencia de plasma durante la incubación inhibió la formación de biopelículas en diez P. acnes aislamientos probados (Fig. 7). Hubo un efecto menor del plasma sobre la formación de biopelículas por el aislado de CoNS (Fig. 7), y la heparina sola no tuvo efecto (datos no mostrados). El crecimiento planctónico de dos P. acnes los aislamientos de infecciones profundas en presencia de plasma al 1% fue algo más lento que en medio sin plasma. Los cultivos alcanzaron la misma densidad óptica final, pero la presencia de plasma retrasó la entrada a la fase estacionaria en aproximadamente 12 h (datos no mostrados). Para excluir la posibilidad de que el efecto sobre la formación de biopelículas de plasma estuviera relacionado con la inhibición del crecimiento bacteriano, se preincubaron los pocillos con plasma, y ​​esto fue seguido por lavado con PBS y análisis de la formación de biopelículas. La preincubación del plasma también disminuyó la formación de biopelículas por P. acnes aislamientos probados (Fig. 7).

Formación de biopelículas de diez Propionibacterium acnes aislamientos en presencia de plasma humano al 5% (izquierda) o en pocillos preincubados con plasma humano y luego lavados con solución salina tamponada con fosfato (derecha). Cada punto (?) Representa la relación entre la formación de biopelículas, expresada como absorbancia a 550 nm, del aislado dado con y sin plasma de un experimento representativo. Como control, se calculó la misma proporción para el aislado de estafilococos coagulasa negativos (X).


Discusión

En el presente estudio, encontramos IIC unidas a inmunoglobulinas (principalmente IgA e IgM) en muchas muestras de ganglios linfáticos sarcoides. Estas IIC estaban ubicadas en macrófagos de los senos nasales y podían diferenciarse fácilmente morfológicamente de las células plasmáticas productoras de inmunoglobulinas. Algunas de estas IIC también se unen al complemento (C1q o C3c), lo que sugiere además que son IIC opsonizadas y fagocitadas por macrófagos sinusales. El tratamiento con IHC con MT, que se desarrolló en el presente estudio para detectar el antígeno central de la IIC, reveló que estas IIC eran positivas para el anticuerpo PAB. La ubicación del antígeno reactivo con PAB y las inmunoglobulinas o el complemento fue idéntica en muchas muestras de sarcoides, lo que sugiere que estas IIC son de hecho formadoras de IIC. PAG. acnes.

El anticuerpo PAB, que reconoce PLTA, es específico para PAG. acnes y no reacciona con otras propionibacterias cutáneas como PAG. granulosum y PAG. avidum [6]. Tratamiento MT para exponer el antígeno central PLTA de la formación de IIC PAG. acnes no afectó la especificidad del anticuerpo PAB para PAG. acnes. La unión no específica del anticuerpo PAB (IgM, κ) con proteínas bacterianas como la proteína A / G y la proteína de unión a inmunoglobulina secretada por estreptococos del grupo A [22] es poco probable, ya que no se observó señal positiva con el anticuerpo LAM (IgM, κ). Unión no específica del anticuerpo secundario comúnmente utilizado para detectar PAG. acnes, inmunoglobulinas y complementos de las secciones también parece poco probable, ya que IHC no detectó una señal positiva sin el anticuerpo primario (control de PBS). Además, los resultados de ISH para PAG. acnes El ADN confirmó la presencia de PAG. acnes en los macrófagos sinusales de los ganglios linfáticos sarcoides que muestran un patrón de distribución idéntico al de la IIC formadora PAG. acnes detectado por IHC con tratamiento MT.

La IIC-formando PAG. acnes parece haberse formado extracelularmente por una reacción in situ antígeno-anticuerpo entre el antígeno PLTA reactivo con PAB de PAG. acnes células y el anticuerpo anti-PLTA en plasma. Básicamente, las reacciones granulomatosas son respuestas celulares a sustancias irritantes, persistentes y poco solubles. Los complejos anticuerpo-antígeno pueden proporcionar un estímulo para la inflamación granulomatosa si el complejo es insoluble y relativamente indigerible [19]. De acuerdo con estos principios básicos de formación de granulomas, la detección frecuente y abundante de IIC formadores PAG. acnes en los macrófagos sinusales de los ganglios linfáticos sarcoides proporciona apoyo para un vínculo etiológico entre la sarcoidosis y PAG. acnes.

Negi et al [6] informaron que muchos SRB reactivos a PAB son detectados por IHC con el anticuerpo PAB en células de granuloma sarcoide y macrófagos paracorticales, pero no en macrófagos del seno linfático donde solo observaron cuerpos HW reactivos a PAB. La imposibilidad de detectar SRB reactivos a PAB en macrófagos sinusales en el estudio anterior puede deberse a la presencia de complejos inmunes formados por SRB reactivos a PAB. La inmunorreactividad alterada del anticuerpo PAB con la formación de IIC PAG. acnes en secciones de tejido sin tratamiento con MT probablemente se deba a la competencia de epítopos [23] entre el anticuerpo PAB y el anticuerpo anti-PLTA en plasma.

El anticuerpo anti-PLTA es un anticuerpo de infección importante específico para PAG. acnes que es comúnmente inducida en sujetos adultos sanos por la bacteria comensal, aunque muchas otras PAG. acnes Los antígenos también inducen anti-PAG. acnes anticuerpos [8,10]. De hecho, se detectó anticuerpo anti-PLTA en todas las muestras de plasma utilizadas para los experimentos de bloqueo en nuestro estudio. En placas ELISA recubiertas con PLTA, la reactividad del anticuerpo PAB con PLTA se inhibió mediante la incubación previa de las placas con muestras de plasma humano, acompañada de la unión simultánea de inmunoglobulinas plasmáticas (IgG & gt IgA & gt IgM) y complemento (C1q & gt C3c). Del mismo modo, en secciones de tejido de PAG. acneshígado de rata infectado, reactividad PAB con PAG. acnes Las células en las células de Kupffer se abolieron totalmente mediante la incubación previa de las secciones con muestras de plasma humano. Además, también se observó la capacidad de las muestras de plasma humano para bloquear la reactividad de PAB para las fracciones de inmunoglobulina o IgG de una muestra de plasma. Estos resultados de los experimentos de bloqueo sugieren fuertemente que los anticuerpos anti-PLTA en plasma contribuyen al efecto de bloqueo contra la reactividad de PAB a través de una competencia de epítopos por su unión a PLTA ubicada en el margen periférico de PAG. acnes. Estos hallazgos también sugieren que con IHC sin tratamiento previo con MT, la IIC que forma PAG. acnes en los macrófagos sinusales de los ganglios linfáticos apenas son detectados por el anticuerpo PAB.

El tratamiento MT (microondas seguido de una breve digestión con tripsina) se desarrolló en el presente estudio para detectar el antígeno central reactivo con PAB de la IIC que forma PAG. acnes. El tratamiento con MT parece disociar la unión de antígeno-anticuerpo entre PLTA e inmunoglobulinas de células formadoras de IIC. PAG. acnes y permitir que el anticuerpo PAB reaccione con el antígeno PLTA expuesto que es resistente a la digestión con tripsina. Esta suposición está respaldada por los resultados del experimento de bloqueo en el que la reactividad de PAB con la formación de IIC PAG. acnes que se había recuperado mediante tratamiento con MT se suprimió mediante incubación con muestras de plasma humano antes de la reacción del anticuerpo primario con el anticuerpo PAB.

La detección de formación de IIC PAG. acnes en macrófagos sinusales sugiere que estos PAG. acnes fueron expuestos al espacio extracelular antes de ser fagocitados. Una posibilidad es que estos PAG. acnesLas IIC derivadas se formaron originalmente fuera del ganglio linfático en órganos ubicados aguas arriba del flujo linfático. Detección predominante de IgA e IgM unidas PAG. acnes puede apoyar esta posibilidad, mientras que no se detectó una correlación entre la ubicación de la biopsia de ganglio linfático y el estado de detección de IHC de estos IIC que forman PAG. acnes en esto. Otra posibilidad es que se hayan formado en los ganglios linfáticos. Negi et al [6] sugirieron que PAG. acnes prolifera intracelularmente en macrófagos paracorticales de los ganglios linfáticos. Algunos macrófagos con proliferación intracelular de PAG. acnes puede alterarse sin ninguna contribución directa a la formación de granulomas y extracelulares PAG. acnes se fagocitan localmente en macrófagos sinusales justo después de la formación de IIC con anticuerpos anti-PLTA en el líquido linfático estromal. Las IIC IgA e IgM multivalentes pueden ser más susceptibles a la fagocitosis local que las IIC IgG monovalentes, porque la frecuencia y el número de IIC IgG fue mucho menor que las IIC IgA e IgM en los ganglios linfáticos sarcoides. Las IIC IgG pueden haber escapado a la fagocitosis local y comportarse como complejos inmunes circulantes en pacientes con sarcoidosis.

La formación de IIC es una reacción de defensa fisiológica del huésped. También se encontraron IIC IgA e IgM en el 21% y el 29% de los ganglios linfáticos de control, respectivamente, donde el tratamiento con MT no funcionó de manera eficiente, lo que no produjo un aumento prominente en el número o la frecuencia de SRB reactivos a PAB. Además, las partículas de IIC en los ganglios linfáticos de control eran generalmente de menor tamaño que las observadas en las muestras de sarcoide. Estas observaciones sugieren que la mayoría de las IIC detectadas en los ganglios linfáticos de control se formaron con antígenos distintos a PAG. acnes.

Aunque los SRB reactivos a PAB (PAG. acnes) parecen ser más frecuentes y abundantes en tejidos de sarcoidosis, también se observan en tejidos de control en ausencia de inflamación granulomatosa. Estos resultados son consistentes con los obtenidos por cultivo bacteriano [3,24,25] y reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa [4,26,27]. Unos pocos PAG. acnes se encuentran en el 20% de los ganglios linfáticos no sarcoides mediante cultivo bacteriano [3], el 15% de los ganglios linfáticos no sarcoides mediante la reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa [4] y el 22% de las muestras de ganglios linfáticos no sarcoides mediante inmunohistoquímica [6] . Según la etiología de la sarcoidosis como infección endógena alérgica [1], la detección ocasional de algunas PAG. acnes en áreas no granulomatosas de los ganglios linfáticos de pacientes no sarcoideos sugiere que latente PAG. acnes la infección se produce incluso en personas sanas [28]. Alternativamente, otra posible interpretación de la presencia ocasional de intracelulares PAG. acnes en los ganglios linfáticos de control es que PAG. acnes son simplemente recogidos por macrófagos en los tejidos de control y sarcoidosis, y que esta característica se ve reforzada por la presencia de granulomas debido a la función especializada de estas estructuras cargadas de macrófagos [29]. Se necesitan más estudios para abordar el papel de PAG. acnes en la etiología de la sarcoidosis.

La diferencia entre el sarcoide y los tejidos de control parece ser la presencia predominante de inmunoglobulina libre o unida a inmunoglobulina. PAG. acnes en macrófagos de los senos nasales. Sin inmunoglobulinas PAG. acnes en los macrófagos de los senos paranasales, incluidos los cuerpos HW, que pueden detectarse sin tratamiento con MT, parece ser latente intracelularmente persistente PAG. acnes. Por el contrario, la inmunoglobulina unida PAG. acnes (IIC-formando PAG. acnes), que se puede detectar con el tratamiento con MT, parece formarse después de la proliferación bacteriana reciente debido a la reactivación endógena de latentes PAG. acnes. De acuerdo con este supuesto, los resultados del presente estudio sugieren que la activación endógena de latente PAG. acnes Ocurre en la mayoría de los ganglios linfáticos sarcoides, algunos controlan los ganglios linfáticos con linfadenitis y en los no controlan los ganglios linfáticos sin inflamación. Activación endógena de latente PAG. acnes puede desencadenar la aparición de la formación de granulomas sarcoides sólo en sujetos susceptibles (p. ej., pacientes con sarcoidosis) con hipersensibilidad Th1 a esta bacteria comensal [7-11,30].

La mayoría de los cuerpos de HW fueron negativos para inmunoglobulinas y, por lo tanto, la frecuencia de detección de cuerpos de HW no aumentó con el tratamiento con MT para detectar la formación de IIC. PAG. acnes. Negi et al [6] sugirieron que los cuerpos de HW son deficientes en la pared celular. PAG. acnes que son persistentes en los macrófagos de los senos nasales, lo que fue apoyado por la observación de la estructura bacteriana deficiente en la pared celular de los cuerpos HW, la característica de división inusual de los cuerpos y los SRB que brotan de los cuerpos HW. En el presente estudio, también observamos SRB densos en electrones en macrófagos sinusales, muchos de los cuales eran reactivos a PAB y estaban colocalizados con inmunoglobulinas IgA e IgM. Algunas de estas SRB se observaron ocasionalmente en fagolisosomas con una apariencia degradada y formación de cuerpos lamelares. Los cuerpos de HW reactivos a PAB se asociaron estrechamente en su morfología y distribución con los SRB reactivos a PAB. Michailova et al [31] utilizaron microscopía electrónica para informar que el fármaco resistente METRO. tuberculosis La forma L presenta variabilidad en tamaño y morfología. Las características de microscopía electrónica de los SRB reactivos a PAB fueron consistentes con las observadas por Michailova et al [31, 32] en términos de tamaño y morfología. Se cree que las bacterias en forma de L de tamaño pequeño indican una fase infecciosa [33]. Aunque la formación de complejos inmunes contra una forma infecciosa de PAG. acnes puede ser útil para prevenir infecciones sistémicas, fagocitosis de IIC que forman PAG. acnes puede causar una infección persistente por la formación posterior de cuerpos HW en los macrófagos de los senos nasales.

La frecuencia de detección por IHC de PAG. acnes dentro de los granulomas no fue muy diferente con y sin tratamiento con MT (95% vs 92%). Detectamos más SRB reactivos a PAB en células de granuloma después del tratamiento con MT en comparación con sin tratamiento con MT, sin embargo, en algunas muestras de pacientes con sarcoidosis. Esta observación sugiere que la formación de granulomas por sarcoidosis es causada no solo por macrófagos con proliferación intracelular de PAG. acnes, sino también por macrófagos que fagocitaron IIC formadores PAG. acnes. PAB-reactividad de PAG. acnes El pretratamiento detectado por IHC con MT fue generalmente más débil en las células del granuloma que en los macrófagos del seno, lo que sugiere que las células del granuloma tienen una mayor capacidad de digestión intracelular que los macrófagos [6,34,35].

El presente estudio tiene varias limitaciones. Primero, no pudimos discriminar entre inmunoglobulinas PAG. acnes y formación de IIC PAG. acnes por la enzima IHC con el anticuerpo PAB después del tratamiento con MT, mientras que podríamos estimar la frecuencia y la cantidad de IIC que forman PAG. acnes en macrófagos de los senos nasales por IHC con anticuerpo PAB después del tratamiento con MT porque sin el tratamiento con MT generalmente había pocas o ninguna inmunoglobulina libre PAG. acnes distintos de los cuerpos de HW en los macrófagos de los senos nasales. En segundo lugar, se realizó microscopía inmunoelectrónica con muestras de tejido FFPE y, por lo tanto, no pudimos determinar la estructura detallada de los SRB reactivos a PAB. Comparamos los resultados de la microscopía inmunoelectrónica y la microscopía electrónica convencional para identificar la IIC que forma PAG. acnes. Para un análisis más detallado de la formación de IIC PAG. acnes, se debe realizar un examen microscópico electrónico más detallado utilizando un método de marcaje con inmunooro con muestras de tejido fresco que se hayan fijado adecuadamente para este propósito.

En conclusión, abundante PAG. acnesIIC derivadas unidas a IgA e IgM se detectaron en macrófagos sinusales de los ganglios linfáticos de muchos pacientes con sarcoidosis. Estos hallazgos pueden reflejar la proliferación local de PAG. acnes en los ganglios linfáticos sarcoides. PAG. acnesLas IIC derivadas pueden proporcionar un estímulo para la formación de granulomas en los ganglios linfáticos en pacientes susceptibles con PAG. acnes hipersensibilidad.