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¿Puede un plásmido causar cáncer?

¿Puede un plásmido causar cáncer?



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¿Puede un plásmido causar cáncer? Según wikipedia, los plásmidos normalmente están presentes en bacterias.

Ellos (plásmidos) normalmente están presentes en bacterias y, a veces, en organismos eucariotas como la levadura [(mi traducción)]

Digamos que inyectamos levadura (por tracto digestivo) en un H. Sapiens (nos centraremos únicamente en el plásmido de la levadura). ¿Es posible que los plásmidos entren en las células eucariotas presentes en el tracto digestivo?


Canónicamente, los plásmidos bacterianos no replicarse en sistemas eucariotas, debido a la falta de los elementos de control (reguladores) necesarios que conducirán a la expresión.

Sin embargo, es posible construir vectores lanzadera que puedan propagarse en células procariotas y eucariotas (por ejemplo, células de levadura o de mamífero como la línea celular inmortal derivada del cáncer de cuello uterino HeLa).

Lo que estás preguntando específicamente es si se produce la transferencia de genes horizontal (lateral) entre procariotas y eucariotas, y si tiene un efecto sobre la célula eucariota. Este artículo de 2016 es un artículo excelente y reciente que analiza esta cuestión.

¿Puede un plásmido causar cáncer?

Nunca se ha demostrado, que yo sepa.

¿Es posible que los plásmidos entren en las células eucariotas presentes en el tracto digestivo?

Muy pocas bacterias pueden penetrar un revestimiento intestinal sano. Sin embargo, en muchos trastornos del sistema gastrointestinal, como en los trastornos inflamatorios del intestino, el revestimiento intestinal se ve comprometido, lo que ciertamente permite el paso de procariotas y / o ADN a la circulación humana. Sin embargo, no se demuestra una transferencia funcional de plásmidos de procariotas a células eucariotas. Tampoco se ha demostrado si la transferencia hipotética conduciría a la carcinogénesis.


La nueva tecnología hace que los tumores cancerosos se eliminen por sí mismos

Una parte del tumor se hizo completamente transparente y se escaneó en 3D con un microscopio especial. Los componentes etiquetados con colores fluorescentes se renderizaron en una representación 3D giratoria en la computadora (rojo: vasos sanguíneos, turquesa: células tumorales, amarillo: anticuerpo terapéutico). Crédito: Plückthun Lab

Una nueva tecnología desarrollada por investigadores de la Universidad de Zúrich permite al cuerpo producir agentes terapéuticos bajo demanda en el lugar exacto donde se necesitan. La innovación podría reducir los efectos secundarios de la terapia contra el cáncer y podría ser la solución para una mejor administración de las terapias relacionadas con Covid directamente en los pulmones.

Los científicos de la Universidad de Zúrich han modificado un virus respiratorio común, llamado adenovirus, para que actúe como un caballo de Troya a fin de administrar genes para terapias contra el cáncer directamente en las células tumorales. A diferencia de la quimioterapia o la radioterapia, este método no daña las células sanas normales. Una vez dentro de las células tumorales, los genes entregados sirven como modelo para los anticuerpos terapéuticos, citocinas y otras sustancias de señalización, que son producidas por las propias células cancerosas y actúan para eliminar los tumores de adentro hacia afuera.

Pasar adenovirus sigilosamente por el sistema inmunológico sin ser detectado

& # 8220 Engañamos al tumor para que se elimine a sí mismo mediante la producción de agentes anticancerígenos por sus propias células & # 8221, dice la becaria postdoctoral Sheena Smith, quien dirigió el desarrollo del método de administración. El líder del grupo de investigación Andreas Plueckthun explica: & # 8220Los agentes terapéuticos, como los anticuerpos terapéuticos o las sustancias de señalización, permanecen en su mayoría en el lugar del cuerpo donde & # 8217 se necesitan en lugar de extenderse por el torrente sanguíneo, donde pueden dañar los órganos y tejidos sanos & # 8217; N.º 8221

Los investigadores de UZH llaman a su tecnología SHREAD: para ADenovirus protegido y reorientado. Se basa en tecnologías clave previamente diseñadas por el equipo de Plueckthun, incluso para dirigir los adenovirus a partes específicas del cuerpo para esconderlos del sistema inmunológico.

Gran cantidad de fármacos en el tumor, baja concentración en otros tejidos.

Con el sistema SHREAD, los científicos hicieron que el propio tumor produjera un anticuerpo contra el cáncer de mama clínicamente aprobado, llamado trastuzumab, en la mama de un ratón. Descubrieron que, después de unos días, SHREAD producía más anticuerpos en el tumor que cuando el fármaco se inyectaba directamente. Además, la concentración en el torrente sanguíneo y en otros tejidos donde podrían ocurrir efectos secundarios fue significativamente menor con SHREAD. Los científicos utilizaron un método de imágenes 3D de alta resolución muy sofisticado y tejidos totalmente transparentes para mostrar cómo el anticuerpo terapéutico, producido en el cuerpo, crea poros en los vasos sanguíneos del tumor y destruye las células tumorales, y por lo tanto lo trata desde el interior. .

Úselo para combatir el Covid-19 que está siendo investigado

Plueckthun, Smith y sus colegas enfatizan que SHREAD es aplicable no solo para la lucha contra el cáncer de mama. Dado que los tejidos sanos ya no entran en contacto con niveles significativos del agente terapéutico, también es aplicable para la administración de una amplia gama de fármacos denominados biológicos y potentes basados ​​en proteínas que de otro modo serían demasiado tóxicos.

De hecho, miembros del grupo Plueckthun están aplicando actualmente su tecnología en un proyecto destinado a ser una terapia para Covid-19. Los vectores adenovirales ya se están utilizando en varias de las vacunas COVID, incluidas las vacunas Johnson & amp Johnson, AstraZeneca, China & # 8217s CanSino Biologics y Rusia & # 8217s Sputnik V & # 8211 pero sin la innovadora tecnología SHREAD. & # 8220Al administrar el tratamiento SHREAD a los pacientes a través de un aerosol inhalado, nuestro enfoque podría permitir la producción dirigida de terapias con anticuerpos Covid en las células pulmonares, donde más se necesitan, & # 8221 Smith explica. & # 8220 Esto reduciría los costos, aumentaría la accesibilidad de las terapias Covid y también mejoraría la entrega de vacunas con el enfoque de inhalación. & # 8221

Referencia: & # 8220La plataforma de terapia génica SHREAD para la administración de paracrina mejora la localización de tumores y los efectos intratumorales de un anticuerpo clínico & # 8221 por Sheena N. Smith, Rajib Schubert, Branko Simic, Dominik Brücher, Markus Schmid, Niels Kirk, Patrick C. Freitag, Viviana Gradinaru y Andreas Plückthun, 17 de mayo de 2021, procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias.
DOI: 10.1073 / pnas.2017925118

Financiamiento: Fundación Nacional Suiza de Ciencias, NIH / Instituto Nacional del Cáncer


Plásmidos

Staphylococcus aureus es un patógeno oportunista que causa infecciones tanto superficiales como invasivas, como sepsis, endocarditis, neumonía y osteomielitis. Debido a la frecuente aparición de cepas con resistencia a antibióticos codificada por plásmidos, es importante comprender cómo S. aureus los plásmidos se transfieren y mantienen.

El plásmido pSA564a pertenece a la gran familia de plásmidos de resistencia a la beta-lactamasa / metales pesados, que también se puede encontrar en las temidas cepas de MRSA como S. aureus N315 y la comunidad adquirida S. aureus USA300. Muchos plásmidos de esta familia proporcionan resistencia a múltiples antibióticos, con pSK1 que codifica genes de resistencia a trimetoprima, amonio cuaternario, gentamicina, tobramicina y kanamicina. Afortunadamente, todos estos plásmidos parecen tener un rango de huéspedes muy estrecho, lo que limita su aparición a S. aureusy sugieren la existencia de un factor de host que se requiere para su replicación.

Se identificó un pequeño transcrito codificado por plásmido (ARN1) en sentido contrario al 5'-UTR del gen de iniciación de la replicación RepA en pSK1 y pN315, y se demostró que este ARN1 inhibe la traducción de la proteína RepA en pSK1. Nuestro laboratorio descubrió recientemente que la deleción de la exoribonucleasa J1 de 5 'a 3' (RNasa J1) da como resultado la pérdida de pSA564a que de otro modo se mantendría de manera estable. Mediante el uso de un vector que se replica independientemente del origen de replicación de pSA564a, podemos demostrar que el ARN1 se acumula en el mutante de ARNasa J1, lo que sugiere que la degradación eficiente del ARN1 es esencial para la replicación de pSA564a. Esta hipótesis se reforzó aún más mediante la clonación de la región que codifica RNA1 en un plásmido de copias múltiples, lo que condujo a la rápida eliminación de pSA564a. RNase J1 es un actor importante en la desintegración del ARN de bacterias Gram-positivas, pero no tiene ortólogo en E. coli, quizás explicando por qué los plásmidos de resistencia a la ßlactamasa / metales pesados ​​tienen un rango de hospedadores tan estrecho.

La helicasa DEAD-box CshA y la exonucleasa PNPasa 3 'a 5' también son factores en la desintegración del ARN y, por lo tanto, fue sorprendente que un triple mutante de ARNasa J1, CshA, PNPasa, aunque extremadamente enfermo, mantenga sin embargo la replicación de pSA564a.

Se utilizó la secuenciación del genoma completo para verificar que pSA564a no se integró en el cromosoma del triple mutante, sino que se mantuvo como un episoma, que debería depender de su propio origen de replicación. Complementar el triple mutante con CshA de tipo salvaje condujo a la pérdida inmediata de pSA564a, mientras que un mutante de sitio activo CshAK52A no lo hizo, lo que demuestra que la actividad helicasa de CshA es un factor importante para la replicación del plásmido.

El trabajo actual se centra en confirmar que la RNasa J1 es necesaria como factor huésped para otros miembros de la familia de plásmidos pSA564a, y en determinar la ruta de desintegración mediada por RNasa J1 del pequeño RNA1 regulador. Además, estamos examinando el mecanismo molecular por el cual la deleción de CshA contrarresta los efectos de la deleción de RNasa J1, y si CshA modifica directamente la formación de estructuras secundarias dentro del ARN1, el objetivo 5'-UTR o la interacción entre los dos. .

¿Lo viejo es nuevo ?: Nuevo horizonte de conjugación en la generación de la biología sintética.

Masakazu Kataoka
Shinshu Universiry, Nagano, Japón

La transferencia conjugativa de plásmidos bacterianos se ha estudiado desde el punto de vista de la propagación de la resistencia a los fármacos en el hospital y la evolución del genoma bacteriano mediante la transferencia horizontal de genes. Además, el factor F ha contribuido en gran medida en la genética de Eschericia coli, y el plásmido Ti ha abierto la puerta a la biotecnología vegetal actual. Creemos que la transferencia horizontal de genes mediante tres mecanismos principales, transformación, transfección y conjugación, ha aumentado la diversidad genética bacteriana. La transferencia conyugal tiene características adecuadas para la biología sintética, ya que está libre de la capacidad de transferir el ADN grande sin exponerlo al agua. La enorme información del genoma de varios organismos se ha acumulado con la aparición del secuenciador de próxima generación y las computadoras de alto rendimiento. La biología sintética del genoma diseñado utilizando la enorme información debe ser uno de los objetivos de la biología de la próxima generación. Sin embargo, el método de manipulación y clonación de un fragmento de ADN grande sigue siendo una forma difícil, y se pueden usar especies bacterianas limitadas para la transformación artificial. Hemos estado tratando de resolver estas dificultades utilizando la transferencia conyugal, un conocimiento relativamente antiguo. En esta reunión de CSHL, me gustaría presentar y discutir nuestros tres desafíos recientes para manejar Streptomyces y Bacilo bacterias.

La transferencia conyugal para el manejo del metabolismo secundario de Streptomyces.
Usamos tres técnicas, la transferencia conyugal entre el E. coli - Streptomyces utilizando el sistema RP4, la inserción del gran fragmento de ADN en el plásmido lineal mediante el sistema de actinófagos, la transferencia conyugal entre Streptomyces por el sistema de conjugación de lineal Streptomyces plásmido. El sistema establecido se puede utilizar para mejorar diversas biosíntesis de muchas cepas de Streptomyces sin desarrollar la operación y transformación de protoplastos.

Transmisión de alta frecuencia del genoma de Streptomyces.
Desarrollamos el sistema de movilización del genoma de alta frecuencia en Streptomyces. El sistema se logró mediante la inserción de un fragmento de 4 kb que codifica genes de transferencia del plásmido de pequeño tamaño de Streptomyces RCR denominado pSN22.

Optimización por transferencia conyugal a Bacillus.
Optimizamos la transferencia conyugal entre géneros entre E. coli y B. subtilis utilizando el sistema RP4. Esperamos que esta técnica se pueda aplicar a cepas que estén estrechamente relacionadas con B. subtilis con dificultades de transformación normal incluyendo B. natto.

Información sobre el plásmidoma de Zymomonas mobilis

Ersi Emmanouilidou 1, NikosTaliouras 1, Valia Tampakopoulou 1, Karen Davenport 2, David Bruce 3, Chris Detter 2, Roxanne Tapia 2, Cliff Han 2, Miriam L. Land 4, Loren Hauser 4, Yun-Juan Chang 4, Chrongle Pan 4 , Vassili N. Kouvelis 1, Lynne A. Goodwin 2, Tanja Woyke 2, Nikos C. Kyrpides 3, Milton A. Typas 1, y Katherine M. Pappas 1*
1 Departamento de Genética y Biotecnología, Facultad de Biología, Universidad de Atenas, Panepistimiopolis, Atenas 15701, Grecia
2 DOE Joint Genome Institute, División de Biociencias, Laboratorio Nacional de Los Alamos, Los Alamos, Nuevo México 87545
3 DOE Joint Genome Institute, 2800 Mitchell Drive, Walnut Creek, California 94598
4 Laboratorio Nacional Oak Ridge, División de Biociencias, Oak Ridge, Tennessee 37831
* correspondiente: [email protected]

Zymomonas mobilis es un organismo candidato para la producción de bioetanol a gran escala debido a su capacidad para fermentar azúcares a etanol más rápido que las levaduras y a mayores rendimientos finales. Para comprender la biología de Z. mobilis, seis cepas diferentes pertenecientes a sus principales subespecies, aisladas de varias partes del mundo, se están secuenciando en el Departamento de Energía de EE. UU. - Instituto Conjunto del Genoma en colaboración con la Universidad de Atenas (CSP_788284 (DNAseq) CSP_52 (RNAseq) http: / /jgi.doe.gov/why-sequence-zymomonas-mobilis-strains/). Los plásmidos de las cepas examinadas han recibido especial atención y se han secuenciado dos veces para cada cepa: una vez en términos de secuenciación WGS y también a partir del material plasmídico proporcionado por separado. Todos Z. mobilis Las cepas albergan plásmidos que varían en números de dos a ocho por cepa, en tamaños de 1.6 kb a 53 kb, y a menudo suman hasta el 8% del genoma de una cepa. Los plásmidos más pequeños se replican en círculos rodantes con muchas copias y algunos son movilizables; son adecuados para la generación de vectores de expresión y clonación específicos de especies. Los plásmidos más grandes son de replicación theta y también son importantes para la creación de vehículos de baja copia para la introducción de genes o bibliotecas. De los más de 600 genes anotados en el secuenciado Z. mobilis En los plásmidos, los genes de interés contienen genes implicados en el metabolismo básico, la formación de estructuras, la regulación, la transposición, la inmunidad (CRISPR) y la tolerancia a agentes adversos, así como genes de mantenimiento. Entre estos últimos, están bien discernidos los genes de replicación, partición activa y toxina-antitoxina. Un montón de Z. mobilis Los genes de plásmidos son específicos de la cepa, mientras que otros tienen homólogos en diferentes cepas. Aparte de los casos en los que se encuentran regiones sinténicas distintas en plásmidos de más de una cepa, ningún plásmido particular parece haberse dispersado horizontalmente y retenido entre cepas en su totalidad. Además, y a pesar de los abundantes elementos IS alojados en la mayoría de las cepas, los cromosomas de las cepas no parecen albergar trazas de material plasmídico. De hecho, en una cepa (NCIMB 11163) se encuentra una región conjugativa completa en el cromosoma y no en ninguno de sus plásmidos (o cualquier otra cepa y plásmidos aposs), como un todo o parte de. Esto da la impresión de que el plásmidoma de Z. mobilis está muy conservado, lo que se ve reforzado por el hecho de que plásmidos de diferentes Z. mobilis Las cepas se han utilizado sistemáticamente a lo largo de los años con fines de elaboración de perfiles de deformación.

Investigación de la transferencia de plásmidos en matrices ambientales utilizando enfoques moleculares

Xavier Bellanger, H & eacutel & egravene Guilloteau, Christophe Merlin *
Laboratoire de Chimie Physique et Microbiologie pour l & aposEnvironnement, UMR 7564 Universit & eacute Lorraine - CNRS, 15 avenue du Charmois, 54500 Vandoeuvre-l & egraves-Nancy, Nancy, Francia
* correspondiente: [email protected]

La transferencia de genes de resistencia a antibióticos mediada por plásmidos es un motivo de preocupación para la salud pública, pero los entornos / condiciones permisivos que apoyan la diseminación de plásmidos son todavía bastante difíciles de identificar. Últimamente, hemos desarrollado un enfoque molecular basado en PCR cuantitativa para monitorear el destino de plásmidos conocidos en comunidades microbianas naturales mantenidas en microcosmos. Prácticamente, consiste en inocular microcosmos con una bacteria donante y monitorear la evolución tanto del plásmido como del ADN del hospedador inicial a lo largo del tiempo. Debido a que la transferencia conjugativa es una forma intercelular de replicación del ADN, la proporción de plásmido a ADN del donante aumenta en el ADN de la comunidad cuando el plásmido se disemina por conjugación en la población autóctona. En la medida en que se dispone de conjuntos muy específicos de cebadores y sondas para la cuantificación no ambigua de ADN de donantes y plásmidos, este método ofrece la ventaja de considerar la transferencia de plásmidos en una amplia gama de posibles bacterias receptoras autóctonas, cultivables o no, y es lo suficientemente sensible como para detectar eventos de transferencia poco frecuentes con un tamaño de inóculo de donante bajo (pero realista). Utilizando el plásmido pB10 de amplia gama de huéspedes IncP-1 y beta como modelo, tales experimentos de transferencia se llevaron a cabo en diversas matrices ambientales, desde sedimentos de ríos hasta lodos activados y estiércol. Estos experimentos demostraron que la transferencia del plásmido pB10 competente en conjugación en entornos complejos es relativamente rara y depende en gran medida de la matriz. La detección de eventos de transferencia exitosa en una matriz ambiental dada parecía estar relacionada con la estabilidad inicial del inóculo del donante. Dependiendo de la matriz considerada, la depredación eucariota juega un papel importante en la limitación o promoción de los eventos de transferencia de plásmidos. Un intento de vincular la estructura de la comunidad microbiana y la permisividad de la matriz mostró que el análisis TTGE no es lo suficientemente resolutivo como para señalar características comunes entre comunidades comparables que apoyan la transferencia de pB10. Sin embargo, una estimación de la abundancia de plásmidos IncP-1 & alfa / & beta mediante PCR cuantitativa demostró que la transferencia de pB10 tiende a ser apoyada por matrices ambientales que exhiben un mayor contenido de plásmidos IncP-1 & alfa / & beta. Sugerimos que la abundancia relativa de plásmidos IncP-1 en una comunidad microbiana dada refleja su permisividad a la transferencia de plásmidos pertenecientes al mismo grupo de incompatibilidad, que prevalece sobre la limitación de transferencia debido al fenómeno conocido como inmunidad a la superinfección.

Conjugar o no conjugar? La importancia de la conjugación en la persistencia de plásmidos grandes depende en gran medida del hospedador.

Porse A, Munck C, Sommer MO
Universidad técnica de Dinamarca

No se comprende bien cómo los plásmidos persisten en condiciones no selectivas en la naturaleza 1. Los primeros esfuerzos para abordar esta cuestión se llevaron a cabo en la década de 1970 mediante el modelado matemático de poblaciones portadoras de plásmidos 2, 3, 4. Estos primeros modelos predijeron una amplia gama de condiciones bajo las cuales los plásmidos conjugativos persistirán mediante la transferencia infecciosa sola. Sin embargo, a menudo se basaron en parámetros obtenidos in vitro utilizando cepas de laboratorio y plásmidos 4,5. Mientras que algunos sugieren que las tasas de transferencia altas son vitales para la supervivencia del plásmido parásito, otros argumentan que las tasas de transferencia que se predice que son necesarias no son alcanzables, ni necesarias, para la persistencia del plásmido en la naturaleza 6,7,8,9. En consecuencia, la importancia de la conjugación en la persistencia de plásmidos ha sido muy debatida en la comunidad de plásmidos 6,8,10.

Hemos investigado los cambios genéticos implicados en la adaptación del plásmido huésped entre un plásmido BLEE clínico y diferentes E. coli y K. pneumoniae Hospedadores. Utilizando la evolución adaptativa y la posterior secuenciación de la población, mostramos que la carga impuesta a las células nativas que reciben un plásmido conjugativo es causada principalmente por la propia maquinaria de transferencia conjugable y varía sustancialmente entre los huéspedes. Sugerimos que las variaciones en la capacidad de regular los genes implicados en la conjugación son la principal causa de las diferencias observadas en el costo del plásmido, lo que finalmente resulta en la eliminación de genes no regulados. Estas observaciones destacan la compensación entre la transferencia horizontal y vertical e indican que el costo de aptitud, que tiene que ser compensado por la maquinaria conjugacional para que el plásmido persista, depende en gran medida del origen del hospedador y que la maquinaria conjugacional puede ser fuertemente alterada. desfavorecido en ciertos anfitriones. Nuestros hallazgos agregan una capa adicional de complejidad a la discusión en curso sobre la importancia de la transferencia conjugable para la persistencia del plásmido en diversas poblaciones bacterianas.

Referencias
1 Harrison, E. y Brockhurst, M. a. La transferencia de genes horizontal mediada por plásmidos es un proceso coevolutivo. Trends Microbiol. 20, 262–7 (2012).
2 Stewart, F. & Levin, B. La biología poblacional de plásmidos bacterianos: condiciones a priori para la existencia de factores de transmisión conjugacional. Genetics 209-228 (1977).
3 Levin, B. R. y Stewart, F. M. Probabilidad de establecer plásmidos quiméricos en poblaciones naturales de bacterias. Science 196, 218-20 (1977).
4 Levin, B. R. DEREPRESIÓN TRANSITORIA Y EL MANTENIMIENTO. 483-497 (1986).
5 Slater, F. R., Bailey, M. J., Tett, A. J. y Turner, S. L. Progreso hacia la comprensión del destino de los plásmidos en las comunidades bacterianas. FEMS Microbiol. Ecol. 66, 3-13 (2008).
6 Lili, L. N., Britton, N. F. y Feil, E. J. La persistencia de plásmidos parásitos. Genetics 177, 399–405 (2007).
7 Bergstrom, C. T., Lipsitch, M. y Levin, B. R. Selección natural, transferencia infecciosa y condiciones de existencia de plásmidos bacterianos. Genetics 155, 1505-19 (2000).
8 Freter, R., Freter, R. R. y Brickner, H. Modelos experimentales y matemáticos de transferencia de plásmido de Escherichia coli in vitro e in vivo. Infectar. Immun. 39, 60-84 (1983).
9 Imran, M., Jones, D. y Smith, H. Biofilms y la cuestión del mantenimiento del plásmido. Matemáticas. Biosci. 193, 183–204 (2005).
10 Tazzyman, S. J. & Bonhoeffer, S. Probabilidad de fijación de elementos genéticos móviles como plásmidos. Theor. Popul. Biol. 90, 49–55 (2013).


Opciones de elución de ADN: TE, tampón Tris o agua

Figura 2: ¿Tris-EDTA, Tris o agua? El búfer que elija podría afectar su experimento posterior.

El tampón TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) es el mejor tampón para preservar la estabilidad de su preparación durante mucho tiempo. El tampón Tris controla el pH, mientras que el EDTA quela los cationes divalentes como el Mg2 +, evitando la actividad de la DNasa. Si bien esto es muy importante para preservar la estabilidad de su ADN, limitará lo que puede hacer con estas muestras. Esto se debe a que los cationes divalentes son cofactores esenciales para muchas herramientas utilizadas en la biología molecular moderna, como las enzimas de restricción y las polimerasas. En la situación en la que necesite usar plásmido en TE para cualquier reacción enzimática, una posibilidad efectiva es diluir su muestra en agua para reducir la concentración de EDTA.

Alternativamente, si la prioridad es utilizar directamente su preparación de ADN en cualquier aplicación posterior que implique reacciones enzimáticas, una alternativa válida puede ser el tampón Tris (sin EDTA) o el agua. Estas son dos de las opciones que ofrecen las empresas para la elución de ADN plasmídico a través de su kit. La ventaja de usar un tampón Tris es que permite un mejor control de la preparación del pH estabilizando el plásmido y aún permitiendo la mayor parte del procesamiento posterior. Por otro lado, el agua libre de nucleasas es una gran opción porque proporciona una gran versatilidad sobre cómo usar su plásmido en cada tipo de experimento. Sin embargo, las dos soluciones pueden diferir en su capacidad para mantener la estabilidad del ADN durante el almacenamiento durante períodos prolongados de tiempo, especialmente a temperatura ambiente oa 4 ° C.


Los investigadores desbloquean el mecanismo causante del cáncer de la toxina de E. coli con un enfoque de biología sintética

Si bien los microbios intestinales humanos como la E. coli ayudan a digerir los alimentos y a regular nuestro sistema inmunológico, también contienen toxinas que podrían detener el ciclo celular y eventualmente causar la muerte celular. Los científicos saben desde hace mucho tiempo que la colibactina, una genotoxina producida por E. coli, puede inducir roturas de doble cadena de ADN en células eucariotas y aumentar el riesgo de cáncer colorrectal en humanos. Sin embargo, la forma en que la colibactina causa daño al ADN sigue siendo un misterio, ya que reconstruir los metabolitos de la colibactina es extremadamente difícil debido a la inestabilidad del compuesto, el título bajo y la complejidad de su vía biosintética.

Ahora, un equipo de investigación dirigido por el profesor Qian Peiyuan, profesor titular del Departamento de Ciencias Oceánicas y la División de Ciencias de la Vida de HKUST, ha descubierto el eslabón perdido utilizando un método biosintético novedoso. El equipo no solo logró clonar el grupo de genes de colibactina, sino que también encontró una manera de producir en masa los genes para su prueba y validación. Después de repetidos ensayos de varios conjuntos de precursores de colibactina, el equipo finalmente identificó a la colibactina-645 como la culpable de las roturas de la doble hebra del ADN y descubrió la vía biosintética del metabolito de la colibactina, así como su mecanismo de causar daño al ADN.

El profesor Qian dijo: "Aunque se ha informado que algunos metabolitos de colibactina dañan el ADN a través de la actividad de reticulación del ADN, la colibactina genotóxica que posee cadenas dobles de ADN directamente aún no se ha identificado. Nuestra investigación ha confirmado que la colibactina-645 ejerce directamente Se rompe la doble cadena del ADN, que desenterró el eslabón perdido que correlaciona la colibactina con sus efectos sobre la salud de los seres humanos ".

LI Zhongrui, investigador del equipo, dijo que la reestructuración del andamio molecular de colibactina proporciona un modelo para diseñar y sintetizar potentes agentes de escisión del ADN, como "enzimas" de restricción sintéticas o agentes quimioterapéuticos.


Proyectos de investigación

El cáncer se ha establecido como la causa más común de mortalidad en Australia. Se estima que 115,000 personas serán diagnosticadas con la enfermedad en 2010, y se espera que más de 43,000 mueran de cáncer (Cancer Council Australia http://www.cancer.org.au/aboutcancer/FactsFigures.htm). Los cambios en el ADN celular provocan la aparición de células cancerosas en el cuerpo, que se definen por su crecimiento incontrolado y su capacidad para invadir y diseminarse por todo el cuerpo. Las células normales del cuerpo siguen un ciclo definido de crecimiento, división y muerte celular programada (apoptosis). Cuando este proceso se rompe, se puede formar cáncer. A diferencia de las células normales, las células cancerosas no experimentan la muerte programática y, en cambio, continúan creciendo y dividiéndose, lo que resulta en una masa de células anormales que crece sin control.

Los tratamientos actuales son capaces de enmascarar los síntomas y retrasar la muerte, proporcionando a veces una remisión temporal. Sin embargo, se requieren terapias dirigidas más efectivas para montar una defensa más eficiente contra esta enfermedad y para combatir la “resistencia” a las terapias actuales. Nuestro objetivo es proporcionar sistemas celulares modelo que nos permitan aumentar nuestro conocimiento y comprensión del microambiente tumoral y la progresión de la enfermedad, así como proporcionar plataformas para mejorar la predictibilidad clínica de los compuestos principales durante el descubrimiento temprano de fármacos.

Las áreas actuales de investigación del cáncer en Discovery Biology incluyen el cáncer de próstata, mama y páncreas. Una variedad de in vitro Se están utilizando metodologías que incluyen la utilización de técnicas de cultivo en 3D y sistemas de imágenes de alto contenido para investigar los mecanismos de las interacciones celulares, el crecimiento, la progresión y la prevención del cáncer, y la identificación de compuestos que actúan específicamente sobre estos.

El desarrollo de fármacos es un ejercicio riesgoso, lento y costoso, por lo tanto, es imperativo seleccionar el compuesto correcto al principio del proceso. Una plataforma que permite la selección de compuestos biológicamente relevantes con alta probabilidad de convertir su in vitro actividad en en vivo actividad, sería muy beneficioso para el proceso de descubrimiento de fármacos, proporcionando una disminución de las tasas de deserción y del tiempo de permanencia en la clínica. Dicho modelo sería robusto, automatizado, imitaría la complejidad del sistema biológico con múltiples vías y mediría las respuestas celulares relevantes para la enfermedad.

High Content Screening (HCS) permite una mayor comprensión de los efectos de los compuestos en el objetivo y de la biología celular asociada y la toxicología predictiva. El cultivo celular en 3D imita el en vivo entorno de forma más realista que las monocapas 2D, lo que permite la interacción sutil de células del mismo o de diferentes orígenes dentro de una red de apoyo. Combinando los dos, estamos desarrollando una plataforma para evaluar múltiples cánceres desde una variedad de niveles.

Descubrimiento de una pequeña molécula de fármaco

Cancer Therapeutics CRC (CTx) (https://www.cancercrc.com) trabaja en estrecha colaboración con los principales investigadores e institutos australianos e internacionales para descubrir y desarrollar descubrimientos de moléculas pequeñas en fármacos candidatos preclínicos para la próxima generación de terapias globales contra el cáncer. Discovery Biology juega una parte integral de CTx, con experiencia en biología molecular y celular, descubrimiento de fármacos y farmacología.

Discovery Biology desarrolla y lleva a cabo ensayos de cribado de alto rendimiento (HTS) para la identificación de compuestos activos de grandes bibliotecas químicas contra objetivos de cáncer candidatos. Después de la identificación de impactos, también realizamos la generación y optimización de prospectos mediante ensayos bioquímicos y celulares adicionales.

Cáncer de mama

Modelado 3D in vitro de cáncer de mama

El cáncer de mama es una enfermedad heterogénea en la que el tratamiento depende de las características del tumor. Las características de los tumores como el tamaño, el grado, las metástasis y el estado de sobreexpresión del receptor son importantes para definir la terapia para los pacientes con cáncer de mama. Los pacientes con cáncer de mama pueden tratarse con uno o más quimioterápicos y / o terapia dirigida. Sin embargo, las respuestas de los pacientes a las terapias contra el cáncer de mama son variables. Por tanto, se requiere una caracterización adicional del microambiente tumoral y los efectos de los fármacos.

Se han desarrollado modelos de cultivo celular en 3D para el cáncer de mama para crear un en vivo-ambiente similar a facilitar la investigación adicional en áreas de interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular en presencia de terapias contra el cáncer de mama. Los modelos de cultivo celular en 3D se desarrollaron en un formato miniaturizado (placa de microtitulación de 384 y 1536 pocillos) y se han caracterizado para su uso en el cribado de fármacos candidatos y en la terapia de combinación. Además, se han identificado varios mecanismos de resistencia a los fármacos utilizando modelos de cultivo de células de cáncer de mama en 3D. Se están llevando a cabo evaluaciones adicionales de las posibles terapias identificadas y los mecanismos de resistencia a los fármacos quimioterapéuticos.

Cancer de pancreas

Modelado 3D in vitro de cáncer de páncreas

El cáncer de páncreas es una enfermedad de muy mal pronóstico y hoy en día sigue siendo uno de los cánceres humanos más letales. No hay forma de detección temprana y hay pocas opciones de tratamiento efectivas. Los avances recientes en los tratamientos solo han aumentado los tiempos de supervivencia en meses, siendo el objetivo una paliación óptima. Actualmente existe una necesidad urgente de desarrollar una comprensión detallada de la biología molecular del cáncer. La investigación en Discovery Biology ayudará a establecer herramientas que pueden usarse para priorizar estrategias para el desarrollo de tratamientos novedosos.

Este proyecto tiene como objetivo desarrollar un modelo de tumor biológico innovador para estudiar el cáncer de páncreas de una manera que se asemeje más a su en vivo medio ambiente. Se utilizará un modelo de cultivo en 3D para obtener nuevos conocimientos sobre la biología pancreática normal y tumoral y facilitar la investigación adicional en áreas de interacciones celulares y descubrimiento de fármacos. Se desarrollarán modelos de cultivo en 3D utilizando matrices comerciales, con una gama de líneas celulares de cáncer de páncreas y en comparación con cultivos en monocapa 2D convencionales. Markers examining cell proliferation, morphology and expression of various signalling pathways relevant to pancreatic cancer have been assessed, as have compounds known to have alternative anti-cancer properties.

Cancer de prostata

Regulation of CXCR4 by the Androgen Receptor in Prostate Cancer

The mortality in prostate cancer (PCa) is attributed to bone metastasis, and the ability of cells to migrate is predominantly mediated by chemokines and their receptors. Of these, CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) has been shown to regulate the metastasis of PCa tumour cells, particularly to bone. The Androgen Receptor (AR) is known as a key regulator of PCa cell growth in the early stages of the disease, and has a role in cancer progression. Normal prostate and early-stage PCa cell lines depend on androgens and AR for growth, and are termed Androgen Dependent (AD). Other cell lines are derived from Androgen Independent (AI) cancer populations, where they have evolved to grow independently of androgens and AR.

There is evidence for inter-regulation between these two receptors over-expression of AR in the DU145 cell line results in down-regulation of CXCR4 mRNA expression, and an inhibition of cell migration to the CXCR4 ligand, Stromal-Derived Factor 1-alpha (SDF-1α). In this research project, we aim to further characterise the regulation of CXCR4 by AR in PCa cells, by investigating how different facets of CXCR4 function are affected by AR expression in AI and AD cell lines. Regulation of CXCR4 by AR has important implications for the development and progression of PCa. Further characterisation of the link between AR and CXCR4 expression and function is necessary to understand the intricate mechanisms through which PCa cells are able to metastasize to bone in the end stages of the disease.

Unravelling Prostate Cancer Pathways with High Content Imaging

Early stage, prostate-confined cancer is generally susceptible to androgen ablation by chemical or surgical treatment. Late stage, metastatic PCa however, is often fatal, as the tumour grows in an AI manner, rendering it more difficult to control. The pathways that lead to metastasis are not well understood and therefore there are no treatments to prevent tumour spread. This project aims to elucidate pathways that are potential targets for therapeutic intervention, particularly those leading to metastasis. High content imaging has been utilized to analyze both 2D and 3D prostate cell cultures for inhibition of cellular proliferation from various compound libraries and sources. Compounds observed to inhibit PCa growth have been assayed for their effects on known PCa-related pathways, as well as pathways selected as candidates, based on live cell tracking with fluorescent labels. Integral to this research is the establishment of 3D cellular models in a microtitre format and the associated image analysis capabilities. Algorithms to allow us to compare 2D with 3D environments are thus necessary.

Further to this, a variety of stable fluorescent cell lines have been created. These contain plasmid constructs of potential anti-PCa targets, tagged to fluorescent proteins. This allows for the rapid high content identification of novel compounds that directly and specifically inhibit the anti-PCa targets previously identified.


How chemotherapy is used to treat cancer

Before I get to the study, in order to help readers not familiar with how chemotherapy is used to treat cancer, I feel obligated to provide a brief primer. There are four main ways that chemotherapy is used to treat cancer:

Curative: Chemotherapy can be the primary (and sometimes only) treatment for cancer. This is common in hematological malignancies, like leukemia and lymphomas, where it’s usually some combination of chemotherapy ± radiation therapy that is curative. Surgery is rarely indicated. The intent here is to use chemotherapy to eliminate cancer from the body.

Adjuvant chemotherapy: Después definitive surgical treatment of the primary cancer, chemotherapy is administered to decrease the chance of recurrence. This is a very common use of chemotherapy, particularly in breast cancer and colorectal cancer. Indeed, the use of adjuvant chemotherapy for breast cancer since the 1980s, among other factors, has contributed to a decline in breast cancer mortality of around 30% since 1990.

Neoadjuvant chemotherapy: Neoadjuvant chemotherapy is administered antes de surgery. In general, there are two main reasons to administer neoadjuvant chemotherapy: (1) to shrink a tumor to make a non-operable tumor (e.g., one stuck to major structures) operable for cure and (2) to make organ-sparing surgery possible. This latter use is common in breast cancer in order to shrink a tumor so that a mastectomy is not required to remove it and breast-conserving surgery is possible. Moreover, in breast cancer, it is known from numerous studies that neoadjuvant chemotherapy results in equivalent results as adjuvant chemotherapy. Overall survival and disease-free survival and time to locoreginal recurrence are the same, whether chemotherapy is administered before or after surgery. The same idea is used in the surgical treatment of low rectal cancer requiring an abdominoperineal resection (APR) to remove. An APR involves removing the anal sphincter and leaving the patient with a permanent colostomy. With neoadjuvant chemotherapy, it is often possible to shrink the tumor enough to make sphincter-sparing surgery possible, something very desirable to patients, the vast majority of whom understandably recoil at the idea of requiring a permanent colostomy.

Palliative chemotherapy: In stage IV disease, chemotherapy is often used to palliate symptoms from growing tumors and can prolong life, although not result in long term survival. This is also a common use of chemotherapy.

The study that the likes of Mike Adams and Chris Wark are crowing over examines neoadjuvant chemotherapy. That’s an important point. It does not apply to other uses of chemotherapy. Think of it this way. Adjuvant chemotherapy is quite different from neoadjuvant chemotherapy in one way. The primary tumor is not present when adjuvant chemotherapy is administered. All that’s left are microscopic tumor deposits that could turn into metastases. Those are what adjuvant chemotherapy targets, because chemotherapy is much better at wiping out microscopic tumor deposits than macroscopic tumors. Contrast that to neoadjuvant chemotherapy, which targets both those same microscopic tumor deposits and also targets the main tumor, which is usually large. (Remember the reasons why neoadjuvant chemotherapy is administered.)

Comparatively speaking, there are many orders of magnitude more cancer cells in the neoadjuvant setting than in the adjuvant setting. If spread of tumor due to neoadjuvant chemotherapy were a major factor clinically, we’d expect survival using neoadjuvant chemotherapy before surgery to be worse than using it after surgery. That we don’t see that is a good reason to be at least a little skeptical of how clinically relevant the results of this study will turn out to be. Indeed, I’ve never ceased to be amazed that, in breast cancer and most cancers for which neoadjuvant chemotherapy is used, the survival benefit provided by chemotherapy (adjusted for tumor stage and other relevant characteristics, of course) is the same regardless of whether the chemotherapy is administered before or after surgery. Even better, neoadjuvant chemotherapy can give an indication of how “nasty” (i.e., resistant to chemotherapy) a tumor is, based on how much (or how little) it shrinks in response to chemotherapy. Moreover, pathologic complete response (that is, a response so dramatic that the tumor not only disappears clinically but the pathologist can’t find any viable tumor cells in the resected specimen) is an excellent prognostic factor predicting favorable outcomes.

Keep these things in mind as I discuss the study.


Genética y cáncer

Algunos tipos de cáncer son hereditarios de determinadas familias, pero la mayoría de los cánceres no están claramente vinculados a los genes que heredamos de nuestros padres. Los cambios genéticos que comienzan en una sola célula a lo largo de la vida de una persona causan la mayoría de los cánceres. En esta sección, puede obtener más información sobre los vínculos complejos entre los genes y el cáncer.

Genes y cáncer

Los avances en genética y biología molecular han mejorado nuestro conocimiento del funcionamiento interno de las células, los componentes básicos del cuerpo. Aquí revisamos cómo las células pueden cambiar durante la vida de una persona para convertirse en cáncer, cómo ciertos tipos de cambios pueden basarse en cambios genéticos heredados para acelerar el desarrollo del cáncer y cómo esta información puede ayudarnos a prevenir y tratar mejor el cáncer.

Síndromes familiares de cáncer

El cáncer es una enfermedad tan común que no sorprende que muchas familias tengan al menos algunos miembros que hayan tenido cáncer. A veces, ciertos tipos de cáncer parecen ser hereditarios. Pero solo una pequeña parte de todos los cánceres se hereda. Este documento se centra en esos cánceres.

Pruebas genéticas para el cáncer

Las pruebas genéticas pueden ser útiles para las personas con ciertos tipos de cáncer que parecen ser hereditarios, pero estas pruebas no se recomiendan para todas las personas. Aquí ofrecemos información básica para ayudarlo a comprender qué son las pruebas genéticas y cómo se usan en el cáncer.


How Mutations in Cell DNA Can Lead to Cancer

Sometimes cancer development is not just about a cell having mutations in its DNA, but about when and how those mutations change the cell’s behavior.

UW Carbone Cancer Center member Peter Lewis, PhD, studies how these behavioral changes can lead to cells becoming cancer – and how clinicians and researchers can take advantage of these changes to more effectively target cancers.

In one aspect of his research, Lewis focuses on how genes are turned on and off during embryonic development, and how misregulation in those genes can lead to some childhood cancers.

“In most adult cancers, tumors likely arise from the accumulation of mutations to tumor-suppressing and promoting genes over many years, and in the right context those mutations can lead to cancers,” Lewis said. “But of course children don’t have decades to accumulate mutations, so how do children get tumors early?”

Lewis and his research group at the Wisconsin Institute for Discovery study how mutations in DNA-organizing histone proteins lead to cancer development. For example, in one type of pediatric brain cancer, 85 percent of all tumors have one histone mutation in common. Lewis and his colleagues have shown that, if present at the right time in development, this histone mutation prevents proper gene regulation and causes the stem cells to remain “stuck” in stem cell form, promoting cancer formation. However, if they introduce the mutation into other cells, cancer does not form.

“Most of us get past this window and develop normally, but the children who get these cancers seem to acquire the histone mutation in these specific cell types and in the right developmental window,” Lewis said. “And there are other types of mutations that only work in other specific types of cancer. We don’t know why some cells are exquisitely sensitive to the mutations at specific times, but we do know it’s not a unique problem.”
Lewis’s work has implications not only in pediatric brain cancers, but also in other childhood cancers, in comparing adult to pediatric cancers and in better understanding early human development.

In some of those other cancers Lewis referred to, different types of mutations arise not in the histones themselves but in the proteins that deposit histones onto DNA. Still, the end result is similar: genes are turned on or off at the wrong time. In some cases, cancer genes turn on, and these mutations are thus linked to aggressive forms of neuroendocrine tumors, neuroblastomas and leukemias, to name a few. In other cases, however, a different set of genes not necessarily linked to cancer formation turns on.

“Eight percent of our genome are inactive viruses that are inserted in our DNA. They’re inactive because of histone-based silencing mechanisms,” Lewis said. “But if the histones aren’t there to silence the viruses, then wacky things go on.”

Those ‘wacky’ things can lead to viral RNA and protein expression, that can serve as signals to trigger immune surveillance mechanisms. In turn, these mechanism signals to the body’s immune system that something is wrong and the cell needs to be eliminated. Lewis and colleagues, including UW Carbone medical oncologist Josh Lang, MD, think clinicians can exploit this immune response during treatment

“We’re looking at how we can selectively de-repress these viruses so we can illicit an immune response as a boost to cancer immunotherapy,” Lewis said. “We’re not directly working on the immunotherapy part right now, but we are working on understanding the mechanisms that silence the viral DNA in tumors that might be super-sensitive to perturbations in the silencing pathways.”


Can a plasmid cause cancer? - biología

Managing PI: Peter Carmeliet - Supervisor: Luc Schoonjans

The function of a gene in biological processes in vivo and its relevance for the pathogenesis of disease can be readily studied by manipulating the genome of animal models (mouse, zebrafish, tadpoles and others). Over the last three decades, the biomedical scientific community has witnessed a (r)evolution in the technical possibilities that have become available to manipulate the genome of these species with great precision, thereby offering unprecedented opportunities to generate disease animal models, elucidate new insight in biological processes in health and disease and propose novel therapeutic concepts and strategies. The latter can be tested by using additional gene manipulation strategies, amongst which gene transfer technologies. The CCB has played a pioneering role in using these technologies to study vascular biology: for instance, they published the first knockout mouse models that were deficient of any type of proteinase or key angiogenic factor, and provided the first genetic evidence, using a knockin strategy, that VEGF also has neuroprotective activities in vivo.


Transgenesis

Commonly used methods to generate transgenic mice (for transgenesis of zebrafish , we refer to the Zebrafis Facility) are available at the CCB: micronuclear injection of transgenes in zygotes (plasmids as well as BAC transgenes, engineered via BAC recombineering) as well as a series of technologies based on the use of embryonic stem (ES) cells: homologous recombination of targeting vectors to inactivate genes (knockout using plasmid or BAC targeting vectors), modifiy coding or non-coding sequences of genes (knockin), conditionally inactivate genes in tissue-specific manner (Cre/LoxP or Flp/Flt technology use of tamoxifen-inducible Cre constructs in combination with or without double-fluorescent Cre reporter mT/mG,mouse), conditionally activate genes (targeting of transgenes, preceeded by a floxed stop cassette, into the Rosa26 locus or tetracycline-inducible rTAT system), set of Cre-mouse lines, etc. Blastocyst injection or aggregation of targeted ES cell clones are routinely used to generate chimeric mice, that are then testbred for germline transmission. Tetraploid aggregation is available to generate completely ES cell-derived embryos. Over 140 different transgenic mouse strains have been generated over the last 22 years. Recently the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 technology is being introduced. It will allow the generation of null, conditional, precisely mutated, reporter, or tagged alleles in mice with unprecedented simplicity and speed.

Several knock-out mouse strains are available for collaborations. Feel free to contact Peter Carmeliet for more information.


Gene Transfer

The mouse genome can be also manipulated via transferring transgenes to somatic cells, using the following techniques, available at the CCB:


Ver el vídeo: 11 Plásmidos 2 (Agosto 2022).