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Digestión con enzimas de restricción

Digestión con enzimas de restricción



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Un plásmido circular de 10.000 pares de bases (pb) se digiere con dos enzimas de restricción, A y B. Esto produce bandas de 3000 pb y 2000 pb cuando se visualiza en un gel de agarosa. Cuando se digiere con una enzima a la vez, solo una banda es visible a 5000 pb.

Si el primer sitio para la enzima A (A1) está presente en la base 100, el orden en el que están presentes los sitios restantes (A2, B1 y B2) es:

(A) 3100, 5100, 8100

(B) 8100, 3100, 5100

(C) 5100, 3100, 8100

(D) 8100, 5100 ,. 3100

NOTA: Esta es una pregunta del examen Kishore Vaigyanik Protsahan Yojana 2014 (corriente SX). Realmente no podía entender el diagrama que se muestra en la solución, y mis profesores tampoco me ayudaron. El diagrama de la solución es:


Examine los efectos de la enzima A por sí sola.

La enzima A realiza dos cortes que dan como resultado 2 fragmentos de 5000 pb de largo. Sabemos que el primer corte se realiza en el 100 pb. Por lo tanto, el segundo corte se realiza en el 5100 bp (A2).

Puede detenerse allí y determinar que la respuesta es C. C es la única respuesta que establece A2 = 5100.


Tampones universales para doble digestión con enzimas de restricción

La doble digestión (digerir el ADN con dos enzimas de restricción simultáneamente) se realiza con frecuencia para ahorrar tiempo. Nuestras enzimas de restricción incluyen tampones universales (consulte la página de actividad del tampón de enzimas de restricción para conocer la actividad relativa en cada tampón), pero para algunos digestiones dobles, puede ser difícil seleccionar un tampón que sea adecuado para ambas enzimas. La selección del tampón es fundamental para obtener una alta actividad de ambas enzimas y para evitar la actividad estrella.

La siguiente tabla enumera el tampón apropiado, el factor de dilución y el aditivo necesario para digestiones dobles comunes. Tenga en cuenta que L, M, H, T y K indican el tipo de búfer. También se indica la concentración de tampón final recomendada (los tampones universales se suministran a una concentración de 10X). BSA se suministra a una concentración 10X para su uso, diluir 10 veces para obtener una concentración final de 0.01%.

Enzima Acc I BamH yo Bgl II Cla I EcoR I EcoR V Hinc II Hind III Kpn I Nco yo Nde I
Suministrado
Buffer
10X M 10X K 10X H 10X M 10X H 10X H 10X M 10X M 10X L 10X K
+ BSA
10X H
Acc I & ndash 0.5X K 1X T 1X M 1X M 0.5X K 1X M 1X M 1X M 1X M
+ BSA
1X T
BamH yo 0,5 y veces K & ndash 1X K 1X K 1X K 1X K 0.5X K 1X K 0.5X K 1X K
+ BSA
1X K
Bgl II 1X T 1X K & ndash 1X H 1X H 1X H 2X K 1X K 1X T 1X K
+ BSA
1X H
Cla I 1X M 1X K 1X H & ndash 1X H 1X H 1X M 1X M 1X M 1X K
+ BSA
1X H
EcoR I 1X M 1X K 1X H 1X H & ndash 1X H 1X M 1X M 1X M 1X K
+ BSA
1X H
EcoR V 0.5X K 1X K 1X H 1X H 1X H & ndash 2X T 1X K 0.5X K 1X K
+ BSA
1X H
Hinc II 1X M 0.5X K 2X K 1X M 1X M 2X T & ndash 1X M 1X M 1X M
+ BSA
1X T
Hind III 1X M 1X K 1X K 1X M 1X M 1X K 1X M & ndash 1X M 1X K
+ BSA
1X K
Kpn I 1X M 0.5X K 1X T 1X M 1X M 0.5X K 1X M 1X M & ndash 0.5X K
+ BSA
1X T
Nco yo 1X M
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X M
+ BSA
1X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
& ndash 1X K
+ BSA
Nde I 1X T 1X K 1X H 1X H 1X H 1X H 1X T 1X K 1X T 1X K
+ BSA
& ndash
Yo no 0.5X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
1X H
+ BSA
1X H
+ BSA
1X H
+ BSA
1X H
+ BSA
0.5X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
1X H
+ BSA
Pst I 1X M 1X K 1X H 1X H 1X H 1X H 1X M 1X M 1X M 1X K
+ BSA
1X H
Pvu I 0.5X K 1X K 1X K 1X K 1X K 1X K 0.5X K 1X K 0.5X K 1X K
+ BSA
1X K
Sac I 1X M 0.5X K 0.5X K 1X M 1X M 0.5X K 1X M 1X M 1X L 0.5X K
+ BSA
1X T
Sal yo 1.5X T 1.5X T 1X H 1X H 1X H 1X H 1,5 veces K 1,5 veces K 1.5X T
+ BSA
1.5X T
+ BSA
1X H
Sma I 1X T
+ BSA
0.5X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
0.5X K
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
Spe I 1X M 1X K 1X H 1X M 1X H 1X H 1X M 1X M 1X M 1X K
+ BSA
1X H
Sph I 0.5X K 1X K 1X H 1X H 1X H 1X H 2X T 1X K 0.5X K 1X K
+ BSA
1X H
Xba yo 1X M 0.5X K 2X T 1X M 1X M 2X T 1X M 1X M 1X M 1X M
+ BSA
1X T
Xho yo 1X M 1X K 1X H 1X H 1X H 1X H 1X M 1X M 1X M 1X K
+ BSA
1X H

Enzima Yo no Pst I Pvu I Sac I Sal yo Sma I Spe I Sph I Xba yo Xho yo
Suministrado
Buffer
10X H
+ BSA
+ Tritón
1X H 10 y veces K
+ BSA
10X L 10X H 10X T
+ BSA
10X M 10X H 10X M
+ BSA
10X H
Acc I 0.5X K
+ BSA
1X M 0.5X K 1X M 1.5X T 1X T
+ BSA
1X M 0.5X K 1X M 1X M
BamH yo 0.5X K
+ BSA
1X K 1X K 0.5X K 1.5X T 0.5X T
+ BSA
1X K 1X K 0.5X K 1X K
Bgl II 1X H
+ BSA
1X H 1X K 0.5X K 1X H 1X T
+ BSA
1X H 1X H 2X T 1X H
Cla I 1X H
+ BSA
1X H 1X K 1X M 1X H 1X T
+ BSA
1X M 1X H 1X H 1X H
EcoR I 1X H
+ BSA
1X H 1X K 1X M 1X H 1X T
+ BSA
1X H 1X H 1X M 1X H
EcoR V 1X H
+ BSA
1X H 1X K 0.5X K 1X H 0.5X K
+ BSA
1X H 1X H 2X T 1X H
Hinc II 0.5X K
+ BSA
1X M 0.5X K 1X M 1,5 veces K 1X T
+ BSA
1X M 2X T 1X M 1X M
Hind III 0.5X K
+ BSA
1X M 1X K 1X M 1,5 veces K 1X T
+ BSA
1X M 1X K 1X M 1X M
Kpn I 0.5X K
+ BSA
1X M 0.5X K 1X L 1.5X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X M 0.5X K 1X M 1X M
Nco yo 0.5X K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
1.5X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X M
+ BSA
1X K
+ BSA
Nde I 1X H
+ BSA
1X H 1X K 1X T 1X T
+ BSA
1X H 1X H 1X T 1X H 1X H
Yo no & ndash 1X H
+ BSA
2X K
+ BSA
0.5X K
+ BSA
1X H
+ BSA
0.5X T
+ BSA
1X H
+ BSA
1X H
+ BSA
0.5X K
+ BSA
1X H
+ BSA
Pst I 1X H
+ BSA
& ndash 1X K 1X M 1X H 0.5X T
+ BSA
1X H 1X H 1X M 1X H
Pvu I 2X K
+ BSA
1X K & ndash 0.5X K 1,5 veces K
+ BSA
1X K
+ BSA
1X K 1X K 0.5X K 1X K
Sac I 0.5X K
+ BSA
1X M 0.5X K & ndash 1.5X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X M 0.5X K 1X M 1X M
Sal yo 1X H
+ BSA
1X H 1,5 veces K
+ BSA
1.5X T
+ BSA
& ndash 1.5X T
+ BSA
1X H 1X H 1.5X T 1X H
Sma I 0.5X T
+ BSA
0.5X T
+ BSA
1X K
+ BSA
1X T
+ BSA
1.5X T
+ BSA
& ndash 1X T
+ BSA
0.5X T
+ BSA
1X T
+ BSA
1X T
+ BSA
Spe I 1X H
+ BSA
1X H 1X K 1X M 1X H 1X T
+ BSA
& ndash 1X H 1X M 1X H
Sph I 1X H
+ BSA
1X H 1X K 0.5X K 1X H 0.5X T
+ BSA
1X H & ndash 2X T 1X H
Xba yo 0.5X K
+ BSA
1X M 0.5X K 1X M 1.5X T 1X T
+ BSA
1X M 2X T & ndash 1X M
Xho yo 1X H
+ BSA
1X H 1X K 1X M 1X H 1X T
+ BSA
1X H 1X H 1X M & ndash

  1. Diez unidades de cada enzima digieren completamente 1 & microg de ADN a 37 & degC en una hora en 50 & microl de mezcla de reacción.
  2. La concentración de glicerol debe ser inferior al 10% para minimizar la actividad de las estrellas.
  3. Es posible que el ADN no se digiera por completo cuando las secuencias de reconocimiento de dos enzimas están próximas entre sí para ADN con conformaciones de estructura alta.

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Diseñe su propio resumen de restricciones

Después de la clonación de un nuevo gen o fragmento de ADN, hay varias formas de confirmar que ha completado con éxito las reacciones de clonación, antes de continuar con los protocolos posteriores. Es muy deseable estar seguro de la integridad de su clon recombinante antes de realizar procedimientos experimentales largos y costosos, como la transfección y los análisis que seguirían. Aunque su gen ya se subclonó en su vector plásmido antes de que lo recibiera, continuaremos con la confirmación de su integridad.

Usaremos la digestión de restricción con enzimas específicas (endonucleasas), además de un paso de "validación" separado mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para confirmar que los insertos (genes) esperados están realmente presentes en sus vectores plasmídicos. Los resultados de estas pruebas se analizarán mediante electroforesis en gel de agarosa, momento en el que compararemos sus resultados con los resultados "esperados" que se derivaron de las secuencias (y tamaños) conocidos de sus genes.

Usando las herramientas web que se describen a continuación, cada equipo elegirá una o dos enzimas de restricción diferentes con las que digerir una pequeña alícuota de sus plásmidos recombinantes. Las opciones deben ser entregadas (por correo electrónico) a SAC por

5:00 PM del viernes siguiente (10/10), dando tiempo para ordenar las enzimas si es necesario. En la siguiente sesión de laboratorio (14/10), se llevarán a cabo reacciones de digestión de restricción con las enzimas elegidas, seguidas de electroforesis en gel de agarosa.

Las enzimas de restricción son proteínas producidas por bacterias que escinden el ADN en niveles específicos, cortos (generalmente

6 pares de bases), haciendo un corte en cada esqueleto de fosfato-azúcar de la doble hélice sin dañar las bases. Por ejemplo, la enzima de uso común Eco R1 (que lleva el nombre de su huésped E coli) hace un corte "escalonado" en la siguiente secuencia (palindrómica), donde sea que ocurra:

Un "palíndromo", en este contexto, se refiere a una secuencia de nucleótidos con una simetría que hace que se lea de la misma manera en la dirección directa o inversa (complementaria), es decir, "GAATTC" y

El ADN cortado luego se separa en fragmentos, a veces con "extremos pegajosos" o "voladizos" como se ve arriba ("voladizo de 5 '" en este caso). Debería ser obvio que un segundo fragmento de ADN con los mismos "extremos pegajosos" (generado por la misma enzima) podría hibridar (unirse a) los extremos ilustrados anteriormente, y todos los fragmentos de ADN podrían unirse (enzimáticamente) para crear un fragmento de ADN recombinante.

En sus células huésped bacterianas nativas, las enzimas de restricción proporcionan protección contra secuencias de ácidos nucleicos invasores extraños (secuencias de reconocimiento similares en el genoma del huésped están protegidas de la digestión por metilación). Para los científicos, estas enzimas son muy útiles para los procedimientos de clonación como se ilustra arriba, y también para detectar / verificar la presencia de secuencias específicas dentro de un fragmento de ADN. La digestión del ADN por las enzimas actualmente disponibles es un procedimiento rápido y relativamente simple y, como tal, estas enzimas son herramientas extremadamente útiles.

Cuando se conoce una secuencia de ADN, se pueden predecir las ubicaciones de las secuencias de reconocimiento para varias enzimas de restricción, a veces con la ayuda de programas como "NEB Cutter", disponible a través del sitio web de New England Biolabs.

Los tamaños resultantes de los fragmentos de ADN generados, visibles en geles de agarosa, se compararán con los tamaños de fragmentos esperados, verificando así que tiene (o no tiene) el inserto específico que se pensaba que tenía.

Elección de sus enzimas de restricción:

El objetivo es utilizar la digestión con enzimas de restricción para distinguir su plásmido recombinante (Gene A, B6 o F) del plásmido de "vector vacío" pCMV6_AC_tGFP. Intente elegir enzimas que produzcan dos o tres fragmentos bien separados de su clon2 y asegúrese de que este patrón de fragmentos distinga claramente su clon del "vector vacío" digerido de la misma manera.

Para diseñar este resumen de restricciones, vaya a NEBcutter:

En Bb, abra el documento de Word que contiene la secuencia de ADN de su gen. A = Rassf1A

B6 = ITGB6 o integrina beta 6

Seleccione / copie la secuencia completa de su gen / plásmido. (No incluya la clave de color en la parte inferior).

Pegue la secuencia en la caja vacía del cortador NEB. Haga clic en "circular" (opcional: nombre la secuencia donde se le solicite, para permitirle un fácil acceso a esta hoja de trabajo) Enviar

Ahora tiene un diagrama que muestra las enzimas de restricción que cortan esta construcción de plásmido / gen una vez ("cortadores simples"). La barra gris designada "a" representa su gen híbrido / tGFP (o gen / mGFP). Para cada gen, la enzima AsiSI marca el límite 5 'de la secuencia del gen, la enzima Mlu I marca el límite 3' de la secuencia para el gen en sí (el inserto), sin embargo, recuerde que el gen de la 'etiqueta' de GFP está aguas abajo de este sitio. Tenga en cuenta estos límites, porque querrá elegir enzimas entre ellos (y excluir esas enzimas "límite").

Hay más de una estrategia correcta para este procedimiento, pero he encontrado que la forma más sencilla es la siguiente (y permite que una sola enzima realice la tarea):

Después de visualizar los "cortadores simples" y observar los límites, proceda al diagrama de cortadores dobles (o triples) seleccionando "2 cortadores" O "3 cortadores" en la pantalla. Ahora localice una enzima que corte en algún lugar dentro de los límites del ORF en sí (y no GFP, si es posible) observe la ubicación de su segundo y tercer sitio (s) de reconocimiento, si corresponde, manteniendo el cursor sobre él y ubicando el rojo áreas subrayadas. Siempre que estos otros sitios estén en algún lugar de la columna vertebral del vector (fuera de "a"), proceda a visualizar los fragmentos esperados de la siguiente manera.

Vaya a Resumen personalizado. Seleccione su enzima de la lista provista y presione el cuadro de resumen verde. Puede presionar la pestaña "Ver gel" para ver los tamaños de los productos (fragmentos) y cómo aparecerían en un gel de agarosa. Si se distinguen en el gel (en lugar de estar demasiado juntos), lo más probable es que su enzima sea una opción factible.

De la misma manera, visualice los fragmentos que obtendría si el vector (pCMV6_AC_tGFP) fuera cortado con esta enzima. Lo más probable es que obtenga un fragmento menos y / o fragmentos de diferentes tamaños, en comparación con su clon recombinante.

Importante: Intente obtener fragmentos que tengan un tamaño de al menos 500 pb y que sean más grandes que

200 pb. Si terminas eligiendo una combinación de dos enzimas diferentes para realizar esta tarea en un 'doble digerir' (en lugar de una sola enzima), debes averiguar si las enzimas son compatibles, es decir, si pueden ser utilizados en una reacción de digestión juntos, en condiciones similares. No todos pueden hacerlo debido a los diferentes requisitos de búfer. Para determinar esto:

Inserte los nombres de las enzimas y anote las condiciones (tampón y temperaturas y cofactores adicionales, como BSA) necesarios para una doble digestión. Si una digestión doble (es decir, ambas enzimas juntas en un tubo) no es factible, elija otro par (puede mantener una de las dos originales). El tiempo no nos permitirá hacer digestiones secuenciales.

En pocas palabras: ya sea que elija una o dos enzimas diferentes para esta reacción de digestión: idealmente, una de las enzimas debería cortar el ADN del plásmido dentro de la región codificante del 'gen de interés', que aparecerá como la 'mitad superior' de la principal ORF (“a”) en el diagrama de corte NEB. (La mitad inferior de ese ORF principal será el gen GFP). Otros "cortes", ya sea por la misma enzima o por una diferente, deben estar en la "columna vertebral" del vector.


Prueba de práctica de biología SAT

51. ¿Cuál de las siguientes mutaciones de sustitución de bases en el ARNm anterior tendría el menor efecto sobre el polipéptido resultante?
(A) sustitución de UCC por UUC en Phe
(B) sustitución de CAA por CCA en Pro
(C) sustitución de CAC por CAG en Gln
(D) sustitución de GGA por GGU en Gly
(E) tanto a como c

52. El patrón de los fragmentos de ADN que resultan de la digestión con enzimas de restricción del ADN genómico de dos especies de mofeta con EcoRI muestra grandes similitudes. Esto sugiere que
(A) la mayoría de los sitios de restricción reconocidos por EcoRI se encuentran aproximadamente a las mismas distancias en el ADN de ambas especies de mofeta
(B) las dos mofetas deben ser de la misma especie, no de especies diferentes
(C) la digestión con enzimas de restricción con EcoRI produce el mismo patrón de fragmentos de ADN en todos los organismos
(D) la composición genética de las dos especies de zorrillos es idéntica
(E) tanto byd

53. La digestión con enzimas de restricción con HindIII de ADN genómico de tres especies de sapos (A, B y C) reveló que las especies A y B producían patrones de fragmentos únicos, mientras que la especie C compartía fragmentos con las especies A y B. Estos resultados sugieren que
(A) la especie C es un híbrido entre la especie A y la especie B
(B) la muestra de ADN de la especie C debe haber estado contaminada
(C) la especie C es el antepasado vivo más reciente tanto de la especie A como de la especie B
(D) la especie C sirvió como un grupo externo para el estudio
(E) tanto a como c

54. Una de las primeras teorías sobre el origen de la vida en la tierra sugirió que la vida comenzó en estanques poco profundos. Estudios recientes han llevado a un extenso debate sobre el origen de la vida, y algunos investigadores sugieren que la vida puede haberse originado
(A) como partículas virales
(B) en volcanes
(C) en marismas
(D) de hebras desnudas de ARN
(E) cerca de respiraderos de aguas profundas

55. La cantidad de pares de bases en una bacteria típica es aproximadamente __________, mientras que la cantidad en células humanas es aproximadamente __________.
(A) 3.000, 3 millones
(B) 1 millón, mil millones
(C) 3 millones, 3 mil millones
(D) mil millones, 12 billones
(E) 2 millones, 3 mil millones

56. Las proteínas alrededor de las cuales se enrolla el ADN humano son
(A) ciclinas
(B) proteínas de choque térmico
(C) proteínas G
(D) proteína metilada
(E) histonas

57. Las proteínas que se unen para formar "factores promotores de la maduración" o "factores de fase M" son
(A) ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas
(B) quinasas dependientes de ciclina y proteínas G
(C) ciclinas
(D) Proteínas G
(E) proteínas que contienen azufre

58. Las enzimas de restricción se aislaron originalmente de
(A) virus, que los utilizan para cortar el ADN bacteriano
(B) bacterias, que las utilizan para cortar el ADN viral
(C) virus, que los utilizan para desactivar el ADN bacteriano de su huésped
(D) protistas, que los utilizan para organizarse en formas de vida coloniales
(E) tanto a como d

59. Si una enzima de restricción tiene como secuencia de reconocimiento "ATCCTA", ¿cuántos sitios de restricción aparecerían en el genoma lambda, que es aproximadamente 54.000 pb?
(A) 2.250
(B) 9000
(C) 13
(D) 7
(E) 9

60. ¿Qué enzima (s) deben usarse para insertar la secuencia humana en el plásmido?
(A) ERA I
(B) CRO I
(C) MEM II
(D) CRO I y ERA I
(E) tanto a como b

RESPUESTAS: DOCUMENTO DE PRÁCTICA DE BIOLOGÍA SAT
51. D
52. A
53. A
54. E
55. C
56. E
57. A
58. B
59. C
60. A


digestión de restricción en línea. Protocolos. NEBcutter (New England Biolabs) Esta herramienta tomará una secuencia de ADN y encontrará los marcos de lectura abiertos grandes que no se superponen y los sitios para todas las enzimas de restricción que cortan la secuencia solo una vez.

Restriction Analyzer es una herramienta de análisis de restricciones en línea. Escanea una secuencia de ADN para detectar la presencia de sitios de restricción y genera resultados tabulares y una secuencia anotada. También puede calcular las longitudes de los fragmentos de restricción y simular una electroforesis en agarosa.


¿Es posible un resumen de triple restricción? - (17 / Nov / 2006)

Estoy intentando escindir un gen de un vector usando HindIII / SalI y ligar un gen de otro vector que se corta con las mismas enzimas de restricción. Es un día raro que obtenga dos vectores con dos sitios compatibles para un intercambio tan fácil (sin PCR)

Sin embargo, aquí está mi problema. El gen I & # 39m que se escinde del primer vector es una secuencia larga, 3,3 kb. El tamaño del vector total es de 6,6 kb, por lo que voy a terminar con dos fragmentos del mismo tamaño y puedo purificar en gel. Sin embargo, he descubierto que el gen contiene un StuI prácticamente en el medio, por lo que pude cortar el gen en dos partes y purificar en gel el resto del vector. SalI, HindIII y StuI son supuestamente compatibles en el mismo búfer, ¿puedo hacer un resumen con los tres al mismo tiempo? ¿O tal vez hacer Stu I primero y seguir con HindIII y SalI?

Solo por curiosidad, nunca había oído hablar de resúmenes triples antes, pero no me importaría guardar un paso.

puede utilizar tantas enzimas de restricción en un resumen proporcionado
1- todas las enzimas pueden trabajar en el mismo búfer
2- que el volumen total de enzima (por tanto, el glicerol total añadido) no supere el 5%. El glicerol inhibe la actividad enzimática.

He usado hasta 3 RE en un solo resumen muchas veces y puedo dar fe de que si se cumplen las condiciones anteriores, su resumen debería estar bien. Pero tenga en cuenta que no todas las enzimas se cortan tan rápido, por lo que está limitado a las enzimas más lentas.

PD: es posible que desee buscar SalI nuevamente. Según NEB, SalI es incompatible con HindIII y StuI. SalI solo funciona en Buffer3. HindIII y StuI pueden usar tampón 2. Sugeriría cortar primero con Hind3 y StuI y luego agregar un poco de tampón3 para que tenga un alto contenido de sal y cortar con SalI. Sin embargo, soy muy prejuicioso contra SalI, es una enzima muy pobre ... dale mucho más tiempo para cortar

Su estrategia me suena bien siempre que las enzimas sean compatibles en el mismo búfer. Puede hacer una ligadura de 3 vías después de eso y unir todo a la vez. Eso debería funcionar bien con los 3 sitios diferentes. Solo verifique que ninguno de los extremos creados sea compatible entre sí y debería estar bien.

El contenido de glicerol debería estar bien. Use 0.5 uL de cada enzima solo para asegurarse. Cada enzima se almacena en una solución de glicerol al 50%, por lo que 0,5 uL de cada enzima en un volumen de reacción de 50 uL dejarán una concentración final de glicerol del 1,5%. ¿No se mantiene la concentración de glicerol por debajo del 5% para evitar la actividad de las estrellas? ¿O también es un inhibidor?

He seguido la misma estrategia que tú para depurar una pieza que era tan larga como el resto del vector. Siempre que sus enzimas sean compatibles con el búfer, continúe (teniendo en cuenta la concentración de glicerol, que para algunas enzimas es al menos un factor en la actividad de las estrellas).

Bueno, creo que tu estrategia suena bien.
¿Pero puedo sugerir simplemente hacer un pcr en un vector no digerido?
Creo que esto llevaría menos tiempo seleccionando varios clones.
Conozco el dolor de la clonación.

Todas mis enzimas de restricción son de Roche, y según su sitio, Sal I está 100% en SuRE cut Buffer H, mientras que Hind III y Stu I son 50-75% en Buffer H. He hecho una doble digestión con Sal I y Eco RV (que también tiene 50-75% de actividad en Buffer H) y funcionó bien. Si empiezo con 2 ug de ADN, ¿durante cuánto tiempo debo hacer el resumen? A menudo hago digestiones nocturnas sin problemas, pero sigo escuchando lo quisquilloso que puedo ser con Sal.

No estoy seguro de entender por qué tendría que analizar muchos clones utilizando este método en lugar de la PCR. Planeo purificar en gel mi inserto y el vector después de la digestión, y dado que tendrán dos extremos pegajosos diferentes, la ligadura debería ser bastante suave, ¿no?

Bueno, quise decir que una mejor estrategia, creo, sería hacer una PCR con una cantidad muy baja de plásmido de corte único. Entonces tendrá su producto pcr en 3300 y el plásmido en 6600.
Gel purifica el producto pcr y digiere.
No tendrá el llamado fragmento no deseado y no tendrá que hacer una triple digestión.


Escisión con enzimas de restricción de fragmentos de ADN marcados con fluorescencia: análisis del método y su uso en el examen de la digestión completa

Las enzimas de restricción han demostrado ser una de las herramientas más valiosas de la biología molecular. En este trabajo, demostramos que la escisión de ADN amplificado por PCR marcado con fluorescencia se puede utilizar como una técnica simple y altamente sensible para la detección de secuencias presentes en un porcentaje tan bajo como 0,6% en un grupo de ADN. Debido al hecho de que el marcaje fluorescente de los fragmentos de ADN permite una detección y cuantificación tan sensibles de la escisión de la enzima de restricción, el método se aprovechó más en el seguimiento de la compleción de la digestión enzimática y en la determinación de los factores que influyen en la eficacia de la enzima de restricción. Analizamos la actividad de seis endonucleasas de restricción, el porcentaje de fragmentos de ADN no escindidos osciló predominantemente entre 2,0 y 2,5 y el valor más alto fue 8,00%. Llegamos a la conclusión de que, dado que no siempre se puede asegurar la compleción de la digestión enzimática, cada ensayo basado en la escisión de enzimas de restricción que se pretende usar en investigaciones de heterogeneidad en un conjunto de ADN debe construirse de manera que la presencia de secuencias escindidas sea la indicación de no uniformidad de la piscina. Cuando la presencia de secuencias no escindidas indica heterogeneidad del conjunto, los resultados pueden ser engañosos debido a la posible insuficiencia de la escisión enzimática.


Digestión con enzimas de restricción - Biología

con la misión de hacer que la bioquímica sea divertida y accesible para todos

Maldita sea, ¿dónde está tu plásmido padre? ¡DpnI necesita eliminarlo! En el plásmido de la plantilla, METHYL marca el lugar & # 10060 pero sus nuevos productos de PCR, este grupo metilo no tienen & # 128077 Dpn-ding en su plantilla y amplifique sus planes posteriores, es posible que deba DPNI DIGEST su reacción de PCR & # 128071

En bioquímica y biología molecular usamos mucha maquinaria proteica (enzimas) que provienen de bacterias que son súper útiles. Pero, lo creas o no, esas bacterias no hacen esas cosas solo para que podamos quitárselas y las hacen ellas mismas, simplemente las robamos.

Tomemos, por ejemplo, las ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN (también conocidas como enzimas de restricción) (también conocidas como tijeras de ADN). Estas moléculas reconocen secuencias específicas en cadenas de ácidos nucleicos (ADN o ARN) y las cortan. Usan esto como una forma de destruir ADN o ARN extraño proveniente de extranjeros como virus invasores de bacterias llamados bacteriófagos (& ldquophages & rdquo)

Pero las bacterias se enfrentan a un dilema: tienen su propio ADN también y está escrito en el mismo idioma, lo cual es genial que todos los organismos e incluso los fagos compartan este código genético común, pero también significa que las bacterias pueden simplemente cortar todo el ADN y el ARN amp dentro de sí mismo o destruirá sus propias instrucciones genéticas y aniquilación mutua ndash

Entonces, la bacteria necesita una forma de distinguir entre su propio ADN y los fagos. Una forma es limitar las tijeras para cortar en secuencias realmente específicas (generalmente palíndromos de 4-8 letras (piense en un kayak o un coche de carreras) y asegurarse de que esas secuencias no estén en su propio ADN. Muchas de las enzimas de restricción que usamos en el laboratorio son De esta manera, utilizamos esa especificidad precisa para cortar con precisión donde queremos que lleguen en un fragmento de ADN.

Esto es muy útil en CLONACIÓN MOLECULAR y si queremos estudiar un gen y / o la proteína para la que tiene instrucciones, podemos usar enzimas de restricción para cortar ese gen de un lugar y ponerlo en otro lugar donde podamos manipular mejor. A menudo, transferimos genes a piezas circulares de ADN llamadas PLASMIDOS que colocamos en las bacterias y luego las bacterias copiarán el plásmido, producirán proteínas a partir de él, etc. (otra forma en que nos aprovechamos de estos tipos)

PERO, recuerde, que las bacterias no existen y hacen las cosas normales que producen. Producen enzimas de restricción para protegerse de esos invasores. Y los invasores pueden ser astutos y ndash, ¿qué pasa si no tienen esas secuencias específicas? Los fagos tienen genomas pequeños, por lo que las posibilidades de que esa secuencia esté allí al azar son pequeñas. Las bacterias "saben" esto, por lo que han evolucionado para dirigirse a las secuencias que necesitan muchos fagos. Pero los fagos pueden evolucionar para tener diferentes secuencias.

Por lo tanto, la bacteria necesita más tijeras `` genéricas '' y fáciles de cortar como respaldo. Pero, maldita sea, ¿cómo protegerán las bacterias su propio ADN? Otras enzimas llamadas METILTRANSFERASAS vienen al rescate. Estos tipos agregan metilo (-CH3) y ldquotags y rdquo en el ADN de las bacterias y rsquos. Esta metilación actúa como una especie de uniforme para decirle al DpnI ¡Hola, estamos en el mismo equipo!

Por lo tanto, la metilación y ldquohides son los sitios de corte de algunas enzimas de restricción, pero algunas bacterias han adoptado el enfoque opuesto, potencialmente porque algunos de esos fagos se volvieron complicados y comenzaron a metilar su ADN. Entonces, las bacterias "decidieron" intercambiar roles, y gt Streptococcus pneumoniae tiene una enzima de restricción, DpnI, que SÓLO corta los sitios metilados. ¡Y esta endonucleasa también puede resultar muy útil en el laboratorio!

Muchas veces, cuando hacemos clonación molecular, hacemos algo llamado MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO y básicamente queremos cambiar solo una pequeña parte del gen, pero mantenerlo en su mismo lugar de plásmido.

Podemos hacer esto de diferentes maneras, pero en su mayoría implican el uso de PCR para hacer copias del plásmido con el error tipográfico que queremos. Le da muchas copias del plásmido nuevo, mutado, pero estos están mezclados con todos esos "ldquooriginals" y necesitamos una manera de eliminar esos plásmidos de plantilla. Más en la publicación de ayer y rsquos http://bit.ly/2oiw6wL

Cuando buscamos la clonación, usualmente usamos un marcador seleccionable como una resistencia a los antibióticos que se encuentra en ese plásmido de manera que solo las bacterias con nuestro plásmido puedan crecer si agregamos ese antibiótico a su comida. Pero los marcadores de selección de antibióticos no nos ayudarán a distinguir entre el plásmido & ldquotemplate & rdquo no mutado y el plásmido mutado que queremos porque la secuencia está en el mismo plásmido, por lo que ambos tienen el marcador de selección.

Entonces necesitamos otra forma de eliminar el plásmido molde. Pero se ven casi iguales, ¿verdad? Existe una diferencia clave que podemos aprovechar: la metilación se agrega en la replicación bacteriana, pero no durante la replicación que hacemos en la PCR (no hay metiltransferasas allí). Por lo tanto, las plantillas originales estarán recubiertas con grupos metilo, pero nuestras nuevas copias estarán libres de metilo.

Entonces, antes de poner el plásmido que hicimos en bacterias, agregamos un poco de DpnI y algunas sales, etc., lo hacemos agradable y acogedor a 37 ° C y lo dejamos hacer su trabajo durante unas horas, y gt el DpnI cortará el plantilla de plásmido pero ganó & rsquot tocar sus nuevas copias. De esta manera, cuando pegue el plásmido en la bacteria, solo las nuevas copias serán "viables" y solo las bacterias que lo absorban podrán vivir porque tienen el marcador de selección de plásmido.


Digestión de ADN con enzimas de restricción

Un 20 μl de reacción es conveniente para la electroforesis en gel de agarosa, pero la escala se puede ajustar.

  • Pipetee lo siguiente en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 ml en hielo: ADN en tampón TE o agua (normalmente de 5 a 50 microgramos) mida la concentración de ADN mediante espectrofotometría) de tampón de restricción 10 (utilice el tampón correspondiente a la enzima, p. Ej., Para HindIII, use Buffer B (Roche) o NE Buffer 2 (BioLab))

H2O a 20 μl (agua de alta calidad, por ejemplo, comprada a Sigma)

  • Agregue 0,3 μl de endonucleasa de restricción e incube durante la noche (o al menos 3 horas) a 37 ° C. El ADN debe digerirse por completo. Las preparaciones de ADN crudo pueden requerir más enzima. El volumen de enzima no debe exceder 1/10 del volumen de la mezcla de reacción final, porque el glicerol en el tampón de almacenamiento de enzima puede interferir con la reacción.
  • Detenga la reacción y prepárela para la electroforesis agregando 2 µl (10% del volumen de reacción) de 10 µl de tampón de carga.
  • Ejecutar en gel de agarosa, teñir con bromuro de etidio y fotografiar. Seleccione el contenido de agarosa (ver más abajo). Para la transferencia Southern se recomienda gel de agarosa al 0,5% y se procesa lentamente con 5 V por cm de longitud de gel (p. Ej., 50 V para gel de 10 cm). Para la mayoría de las aplicaciones, preferimos el búfer TBE (más capacidad de búfer pero más caro que el TAE).

Concentraciones de agarosa apropiadas para separar fragmentos de ADN de varios tamaños.

puede subir hasta un 7% para una resolución por debajo de 100 bases, pero tenga en cuenta que el costo es & gt 5 $ USD10 por gel, y la electroforesis de acrilamida puede ser más apropiada


Digerido de restricción con enzima VIEJA

Sospecho que la mayoría de los laboratorios son como el mío, con congeladores rebosantes de enzimas de restricción viejas y sin usar, compradas para un poco de clonación, usadas una vez y luego guardadas en el congelador para siempre.

En la mayoría de los laboratorios en los que he trabajado, la regla general para las enzimas desactualizadas era simplemente agregar algunas unidades más (hasta el 10% del volumen total permitido para evitar que el glicerol inhibiera la reacción), y tal vez ejecutar un poco más .

Sin embargo, no fue hasta mi laboratorio actual que encontré enzimas REALMENTE viejas. Como en, enzimas más antiguas que algunos de los doctores más jóvenes del laboratorio.

Siempre sospeché que las fechas de vencimiento de estos son en gran parte conjeturas, así que pensé en probar las enzimas más antiguas que pude encontrar.

Quería ir con una alícuota de AluI que encontré, fechada para septiembre de 1989 (aunque no dice si esta es una fecha de vencimiento o cuándo se hizo). Desafortunadamente, la tapa de AluI se pierde en las brumas del tiempo, el tubo está lleno de hielo (probablemente de 20 años).

However, I did find a tube of BstYI that appears to be of a similar age, perhaps even older the labelling is fairly similar, but the lack of a date makes me question whether it predates the AluI (and inclusion of estimated expiration dates). Maybe there's someone at NEB who can sort this out - I'll investigate that. At the very earliest, it seems BstYI would have appeared around 1988.

I mixed up a quick 20μl digestion mix, using 2μl enzyme in NEBuffer 4 to digest around a microgram of pUC19 plasmid DNA, incubated at 65°C for two hours.

Lo and behold, it works just fine (presumably - I don't have any in-date BstYI to compare this against). This is an enzyme that is likely somewhere in the region of 25 to 28 years old. I'm not sure if I'll ever pay attention to expiration dates again.

NB: doing a quick search around for this write up showed me this article, which makes me wonder if I shouldn't be surprised it implies that the companies don't tend to make up many batches of these enzymes, just thaw old ones and assay them for activity!

It's also probably worth noting that this seems to be a fairly robust enzyme, which has been kept at minus twenty for the vast majority of its life (it looks barely used), thus these findings might not apply to other enzymes.


Ver el vídeo: Digestión con enzimas de restricción (Agosto 2022).